肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范围内高发的恶性肿瘤,其中超过50%的新发和死亡病例发生在中国,严重威胁人类生命健康。目前,手术切除和介入消融治疗仍为临床上早期HCC的首选治疗手段,但其具有发病隐匿、恶性程度高且进展迅速等特点,这也导致75%以上的患者临床确诊时已处于中晚期,失去外科手术切除的最佳时机。针对这部分中晚期肝癌患者,临床上主要采用放化疗、靶向治疗和介入治疗等姑息疗法,其中以经导管动脉化疗栓塞术(Transcatheter arterial chemoembolization,TACE)为基础的介入综合治疗在临床上快速发展,已成为多个原发性肝癌诊疗指南推荐的首选治疗方案,并逐渐发展成为不可手术切除肝癌的基础治疗策略。然而,临床实践中经TACE治疗的肝癌患者临床获益仍极为有限,肿瘤客观反应率仅为44%,且短期复发率高达29%,极大地限制了TACE在临床上的广泛推广应用。TACE治疗的基础是堵塞肿瘤供血动脉切断肿瘤的营养供给,并进一步联合化疗作用,从而发挥化疗栓塞治疗作用,但TACE术后营造的独特缺氧酸性微环境与肿瘤的局部进展、复发和远处转移密切相关,被认为是影响肿瘤生物学进程的关键因素。基于此,如何有效改善TACE术后的缺氧微环境以及酸性微环境是提升其治疗效能的重要策略,这将能在现有的常规化疗栓塞的基础上,有效提升TACE的抗肝癌能力,显著增加患者的整体临床获益。载药微球是目前临床上常用的TACE治疗药物,相比其他栓塞治疗药物,其具备可控性高、可重复性好、疗效确切且毒性作用少等优点,目前在临床上广泛使用的微球主要分为以聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA)为基础材料的载药微球和以超吸收性聚合物(Superabsorbent polymer,SAP)为基础材料的载药微球两大类型。基于此,本研究将以载药微球作为平台,以载化疗药的微球为基础,通过在介入栓塞治疗体系中引入不同的药物,从而赋予载药微球对不同肿瘤微环境调控能力,进而发挥更强的抗肝癌效能。在本研究中,我们首先将缺氧诱导因子2α(Hypoxia-inducing facinfectious spondylodiscitistor 2α,HIF-2α)抑制剂PT-2385引入到微球中,使微球能够靶向抑制HIF-2α,从而改善肿瘤缺氧微环境,提升微球的抗肝癌效能;其次,我们将CaCO_3颗粒引入到微球中,使微球能够有效改善肿瘤酸性微环境,并具备良好的pH响应性,同时,进一步在微球体系中加入铁死亡激动剂Erastin,赋予微球铁死亡诱导能力,从而全面增强微球的抗肝癌作用。本研究的主要内容如下:第一部分:以靶向抑制HIF-2α为目标,实现肿瘤长期缺氧微环境的改善,以PT-2385作为HIF-2α抑制剂,PVA和HA为微球壁材,通过乳化交联法实现PT-2385和阿霉素(Doxorubicin,DOX)的高效共载,制备得到具有HIF-2α靶向抑制能力的新型多功能载药微球PT/DOX-MS。我们研究发现以PVA/HA为壁材的微球能够高效包载PT-2385以及DOX,包封率分别达到了83.7±3.07%和84.3±1.08%,且两者的共载并没有影响各自的包封效率。我们进一步探索了PT/DOX-MS在PBS(pH 7.4)、PBS(pH 6.5)以及在含10%FBS的PBS中的稳定性及药物释放行为。以PBS(pH 7.4)的介质,研究发现PT/DOX-MS在30天内保持了良好的稳定性,并未出现明显的降解现象,且PT-2385和DOX均能够实现长期有效的缓释,在30天时的释放量分别达到了87.3±6.9%以及61.17±3.22%,且发现PT-2385的释放行为对DOX的释放产生了一定的影响。以PBS(pH 6.5)为介质,模拟肿瘤酸性微环境,发现PT/DOX-MS在酸性条件下仍具有较好的稳定性,也展现出了良好的缓释性能,在孵育30天后PT-2385和DOX的释放量能够分别达到84.3±4.2%以及68.2±6.1%,且DOX在PT/DOX-MS中的整体释放速率略高于DOX-MS。以含10%FBS的PBS为介质,模拟体内血液环境,研究发现PT/DOX-MS在含血清的孵育系统中仍然具有良好的稳定性,同样展现出了良好的缓释性能,在孵育30天后PT-2385和DOX的释放量能分别达到84.9±5.4%和66.63±6.90%。以LM3细胞和N1S1细胞为模型细胞开展PT/DOX-MS的体外药效学及作用机制研究。研究发现LM3细胞对PT/DOX-MS释放的DOX能够有效摄取,且摄取行为显示出较强的时间依赖性。细胞活性评价研究发现空白微球PVA/HA-MS本身对肿瘤细胞并无明显的杀伤作用,具有优异的生物安全性。体外抗肿瘤作用研究发现相比其他微球,PT/DOX-MS的抗肿瘤作用最强,能够有效诱导肿瘤细胞凋亡,且能将肿瘤细胞阻滞在G2/M期,阻止肿瘤细胞进行下一次细胞分裂,从而导致细胞衰老和死亡。我们进一步研究发现PT/DOX-MS对HIF-2α具有较强的靶向抑制能力,并可进一步抑制VEGF、TGF-α以及Cyclin D1等细胞因子,协同DOX的VEGF抑制能力以及细胞核毒性,从而高效发挥抗肝癌作用。我们进一步利用高通量RNA深度测序方法(RNA deep sequencing,RNA-seq)对经PT/DOX-MS处理的肝癌细胞转录组进行了分析,研究结果显示其特征性调控过程涉及经典Wnt信号通路、组蛋白乙酰转移酶复合物、转录共调节活性等,其作用机制是一个多种信号通路参与调控的复杂生物学过程。利用SD大鼠构建了稳定PF-03084014体内实验剂量的大鼠原位肝癌模型,并基于此进行介入栓塞治疗研究,对不同微球的体内抗肿瘤作用、作用机制以及生物安全性进行了探索。通过本研究在动物层面构建了稳定的介入栓塞治疗体系,研究证实其能够有效将微球递送到肿瘤区域,实现肿瘤供血动脉的堵塞。体内药效学研究结果显示相比其他微球,PT/DOX-MS展现出了卓越的肿瘤清除能力,对进行介入栓塞治疗的6只大鼠进行随访,发现治疗后1周肿瘤体积缩小至治疗前体积的35%,且有2只大鼠肿瘤消失,随访2周后另有3只大鼠肿瘤也同样消失,最终仅有1只大鼠在随访2周后仍存在肿瘤,但其体积也减少到治疗前的45%,整体展现出了极强的肿瘤清除能力。病理层面的研究结果也证实PT/DOX-MS组存在明显的坏死细胞,坏死面积明显大于其他组别,同时,其肿瘤部位脂质沉积明显,表明其肿瘤细胞代谢受阻,且实现了最大比例的肿瘤细胞凋亡,展现出了最强的体内肿瘤抑制能力。体内肿瘤组织的免疫组化结果也进一步表明PT/DOX-MS同样能够有效靶向抑制体内肿瘤组织HIF-2α的表达,并进而对TGF-α、Cyclin D1和VEGF展现出较强的抑制作用。此外,我们也发现经PT/DOX-MS介入栓塞治疗后并不会影响大鼠的心、肺、脾和肾等重要器官,不会引起全身系统性毒性,具有良好的生物安全性。第二部分:本部分研究以肿瘤酸性微环境的改善为目标,将CaCO_3引入到微球中,以明胶为微球壁材,在常规化疗栓塞微球的基础上,进一步加入铁死亡激动剂Erastin,赋予微球铁死亡诱导能力,首先采用W1/O/W2双乳液法制备Erastin/DOX@CaCO_3纳米粒,并进一步利用乳化-溶剂挥发法制备得到Erastin/DOX@CaCO_3明胶微球(Erastin/DOX@CaCO_3-MS)。在本研究中,我们深入探索了该新型多功能微球的理化性质、体内外抗肝癌效能以及生物安全性。我们首先以LM3细胞和Hep1-6细胞作为模型细胞,探索乳酸介导的酸性微环境对肝癌细胞的化疗敏感性以及铁死亡敏感性的影响。我们研究证实了乳酸能够显著降低肝癌细胞对化疗以及铁死亡的敏感性,使肿瘤细胞对DOX及Erastin产生明显耐受性,这也表明乳酸能够对肝癌细胞产生化疗以及铁死亡保护作用,显著降低上述两种药物对肿瘤细胞的杀伤作用。同时,我们也发现随着CaCO_3的加入,乳酸的保护作用被有效打破,其能将肝癌细胞对DOX和Erastin的敏感性有效提升,全面改善两种药物的肿瘤细胞杀伤能力。我们进一步研究证实了经乳酸处理后,肿瘤细胞中铁死亡标志物溶质载体家族7成员11(Solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)及谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)的表达明显升高,提示乳酸能够抑制Erastin诱导的铁死亡,而经CaCO_3拯救后能够有效逆转乳酸对Erastin诱导的铁死亡的抵抗作用,SLC7A11及GPX4的表达显著减少。同时,经乳酸处理后,我们发现Erastin诱导的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平下降,而CaCO_3拯救后能够有效逆转乳酸诱导的铁死亡抵抗作用。此外,我们也进一步证实了乳酸处理后,肿瘤细胞中谷胱甘肽(Glutathione,GSH)显著增加,而经CaCO_3拯救后,其水平能够明显下降,这也进一步表明乳酸可提高GSH的水平,并降低脂质过氧化作用,使肝癌细胞抵抗Erastin诱导引起的铁死亡。在本研究中,我们通过W1/O/W2双乳液法制备Erastin/DOX@CaCO_3-NPs,并进一步利用乳化-溶剂挥发法成功制备得到了Erastin/DOX@CaCO_3-MS,发现其呈球形,由于CaCO_3颗粒附着在微球表面导致表面粗糙,其粒径为30.8±0.12μm,对DOX的包封率和载药量分别为81.37±3.46%以及0.62±0.45%,对Erastin的包封率和载药量分别为97.24±2.14%和2.33±0.72%。我们研究发现Erastin/DOX@CaCO_3-MS对Erastin以及DOX均展现出了良好的缓释性能,且由于CaCO_3的存在,使得微球的药物释放行为具有一定的pH响应性,在弱酸条件下,Erastin在15天时的释放量能从pH 7.4条件下的44.16±0.05%提升至50.56±2.55%,而DOX能从pH 7.4条件下的30.62±0.03%增加至65.54±0.03%,累积释放量更是增幅达114%,这与在弱酸条件下,微球表面的CaCO_3持续与微酸中的H~+中和,从而破坏微球导致微球内壁的药物迅速溶出所致。以LM3细胞和Hep1-6细胞作为模型细胞开展Erastin/DOX@CaCO_3-MS的体外药效学评价研究。研究发现Erastin/DOX@CaCO_3-MS具有较强的pH响应性,能够显著提升酸性条件下DOX的入胞效率,并发现其细胞毒性在有无乳酸存在的条件下均显著强于其他组别的微球,且在酸性条件下其细胞杀伤能力明显增强,进一步证实了微球的pH响应能力。细胞凋亡研究结果也发现经Erastin/DOX@CaCO_3-MS处理的细胞凋亡数量均明显多于其他组别的微球,表明其抗肿瘤能力最强,在乳酸存在的情况下,其对肿瘤细胞的杀伤能力也明显更强,表明其能够有效改善肿瘤酸性微环境下的肿瘤杀伤能力。同时,我们也发现经Erastin/DOX@CaCO_3-MS处理后肿瘤细胞的细胞膜均出现断裂,线粒体萎缩、脊减少的形态变化,引起细胞铁死亡形态变化,证实了微球能够诱发铁死亡。此外,我们的研究也进一步证实CaCO_3-MS本身并不具备铁死亡诱导能力,而经Erastin/DOX@CaCO_3-MS处理的肿瘤细胞,无论在有无乳酸的情况下肿瘤细胞铁死亡均最为明显,且在酸性条件下,其铁死亡诱导能力显著增强,表明其诱导铁死亡方面的能力同样具有pH响应性。利用小鼠皮下移植瘤模型以及大鼠原位肝癌模型对Erastin/DOX@CaCO_3-MS进行了体内药效学及生物安全性研究。研究发现Erastin/DOX@CaCO_3-MS中的药物具有良好的肿瘤蓄积能力,能够在肿瘤部位长期停留,并未在其他器官中观察到荧光信号,这可能与CaCO_3能够作用于体内肿瘤酸性微环境相关,提升了肿瘤细胞对药物的摄取能力。以Hep1-6荷瘤小鼠为模型动物,通过瘤内注射评估不同微球的体内抗肝癌作用,研究发现相比其他微球,Erastin/DOX@CaCO_3-MS展现出了卓越的肿瘤抑制能力,其肿瘤体积明显小于其他组别,且肿瘤抑制能力明显优于其他组别。利用大鼠原位肝癌模型评价了不同微球的体内介入栓塞治疗的抗肝癌能力,研究也发现相比其他组别的微球,Erastin/DOX@CaCO_3-MS对肿瘤体积增长的抑制能力最强,具备最强的抗肿瘤作用。Ki-67免疫组化染色以及TUNEL染色的结果也进一步证实了Erastin/DOX@CaCO_3-MS具有最强的体内抗肝癌作用。此外,我们也发现Erastin/DOX@CaCO_3-MS具有良好的生物安全性,不会产生全身系统性毒性。本研究所设计并制备的PT/DOX-MS和Erastin/DOX@CaCO_3-MS两种多功能载药微球,分别以缺氧微环境调节以及酸性微环境改善为目的,均可有效实现肝癌的介入栓塞治疗以及药物的长期缓释作用,在常规化疗栓塞的基础上,进一步有效提升了微球的介入栓塞治疗效能,并具备良好的生物Proteasome抑制剂安全性,可实现安全高效的肝癌介入栓塞治疗。