目的:高度近视(High myopia,HM)是严重的致盲性眼病。近些年近视及高度近视发病年龄提前,患病率显著增加,遗传因素在HM的发生发展中起到重要作用。本研究拟调查新疆地区维吾尔族及汉族学生近视、高度近视患病率,分析相关危险因素。利用全外显子组测序(Whole exome-sequencing,WES)筛选维吾尔族非综合征性HM家系致病基因,并通过动物水平的建模及分子水平和细胞水平的实验,验证候选致病基因功能。以期填补新疆地区近视流行病学资料空白,丰富高度近视基因数据库,为高度近视的诊断和治疗提供依据。方法:第一部分:(1)采用多阶段分层随机抽样的方法进行横断面研究,在新疆地区84033名4-23岁汉族及维吾尔族学生中进行视力检查和非睫状肌麻痹自动验光检查。调查近视、高度近视患病率并计算年龄及性别调整患病率;(2)使用logistic回归模型分析近视及高度近视的危险因素。第二部分:(1)从流行病学调查发现的早发型高度近视维吾尔族儿童先证者入手,寻找到一个包含4代、19名成员(高度近视患者9名)的维吾尔族高度近视家系,进行详尽的眼科检查获取临床资料,绘制家系图谱;(2)对核心家系成员中的4名高度近视者和2名正常对照者进行全外显子组测序,结合生物信息学技术筛选高度近视相关致病基因;(3)利用Sanger测序在家系所有成员中进行候选基因的家系共分离验证,并验证二代测序的准确性;(4)在100例散发高度近视者与100例正常对照者中进行目标区域多重PCR扩增子测序,验证在高度近视家系中发现的致病基因和突变位点,在散发高度近视人群和正常对照人群中是否存在,并寻找致病基因其他的突变位点;(5)对发现的突变位点进行致病性预测、保守性分析、突变位点分布分析和突变蛋白模拟建模,以推测基因突变后对其编码蛋白结构和功能的影响。第三部分:(1)通过实时荧光定量PCR(Real-Roxadustat采购time quantitative PCR,q RT-PCR)、蛋白质免疫印迹(Western blowww.selleck.cn/products/cobimetinib-gdc-0973-rg7420t,WB)、免疫荧光(Immunofluorescence,IF)和免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)实验,验证Ppef2基因(protein phosphatase with EF-hand domain 2)在小鼠眼球各个组织的表达情况;(2)构建PPEF2野生型、致病突变位点的点突变型慢病毒,分别瞬时转染人胚肾细胞(Human Embryonic Kidney 293T,293T)、稳定转染人视网膜上皮细胞(Adult Retinal Pigment Epithelial cell line-19,ARPE-19)构建稳定表达目的基因的细胞系;(3)通过q RT-PCR、WB和免疫荧光实验验证PPEF2突变对其在m RNA和蛋白水平的表达及亚细胞定位的影响;(4)通过划痕、CCK-8、平板细胞克隆形成实验、细胞流式检测凋亡及细胞周期实验来验证突变对细胞生物学行为的影响;(5)构建形觉剥夺性近视(Form deprivation myopia,FDM)小鼠模型,活体测量小鼠眼屈光度与眼部生物学参数确证模型构建成功。并利用q RT-PCR、WB、免疫荧光及免疫组化实验,初步验证Ppef2基因与近视表型之间是否有关联。结果:第一部分:(1)新疆地区总体近视的年龄及性别调整患病率为47.70%(95%CI:47.67-47.74),高度近视的年龄及性别调整患病率为2.55%(95%CI:2.54-2.56);(2)与维吾尔族学生相比,汉族的近视患病率(χ~2=5518.18,P<0.0001)和高度近视患病率(χ~2=300.51,P<0.0001)均较高,汉族的近视患病率是维吾尔族的2.12倍(57.01%vs 26.88%),高度近视患病率是维吾尔族的近4倍(2.85%vs 0.72%);(3)等效球镜(Spherical equivalent,SE)度数水平随年龄的增长而下降,近视和高度近视的患病率随年龄的增长而上升;(4)汉Diagnostic serum biomarker族、年龄、女性、高学历、居住在城市是近视及高度近视的危险因素。居住在北疆地区是近视的危险因素,但与高度近视的发病呈负相关。第二部分:(1)全外显子组测序在维吾尔族高度近视家系中筛选到一个符合家系共分离的PPEF2的罕见杂合错义突变c.875A>G(p.H292R),且该突变在100例正常对照者中不存在;(2)目标区域多重PCR扩增子测序在100例散发高度近视患者中发现了PPEF2的其他罕见的杂合错义突变c.1959C>G(p.N653K),该突变在100例正常对照者中不存在;(3)PPEF2基因c.875A>G(p.H292R)突变和c.1959C>G(p.N653K)突变均位于PPEF2蛋白重要的功能区和结构域中,高度保守,致病性预测为有害突变,蛋白模拟建模显示均发生了不同程度的蛋白结构改变。第三部分:(1)Ppef2在小鼠的视网膜色素上皮和脉络膜组织复合物、视网膜组织中表达,在角膜组织、虹膜组织、晶状体组织和巩膜组织中无表达。免疫荧光和免疫组化实验显示PPEF2蛋白在视网膜神经节细胞层、内网状层、内核层、外网状层、外核层、内节层、视网膜色素上皮层均有表达,其中在感光细胞突起形成的内节层也就是视杆细胞内段,以及外核层光感受器细胞胞体中表达较强烈;(2)在293T细胞和ARPE-19细胞中,PPEF2基因的c.875A>G突变均导致其在m RNA和蛋白水平的表达降低,但对PPEF2蛋白亚细胞定位无影响;(3)PPEF2基因的c.875A>G突变导致ARPE-19细胞的迁移能力和增殖能力下降,促进细胞发生凋亡;(4)在FDM小鼠中,Ppef2基因的m RNA表达水平和蛋白表达水平下调。结论:(1)汉族学生的近视、高度近视患病率高于维吾尔族,但维吾尔族近视患病率的增长趋势高于汉族;(2)汉族、年龄、女性、高学历、居住在城市是近视及高度近视的危险因素。居住在北疆地区是近视的危险因素,但与高度近视的发病呈负相关;(3)PPEF2基因是该维吾尔族高度近视家系的致病基因,其突变导致维吾尔族非综合征性高度近视;(4)PPEF2基因突变可能通过调控视网膜细胞的迁移、增殖和凋亡而引起高度近视。