目的:本课题基于水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)探讨NOS/NO/c GMP途径在慢性心力衰竭中的作用及当归芍药散的干预作用,阐明慢性Etoposide临床试验心力衰竭大鼠水液代谢障碍的分子机制,为慢性心力衰竭的治疗及当归芍药散的临床应用提供实验依据。方法:第一部分当归芍药散对慢性心力衰竭大鼠水液代谢障碍的影响选择雄性SD大鼠,采用少量多次腹腔注射阿https://www.selleck.cn/products/bmn-673.html霉素(1周2次,每次2 mg·kg~(-1),共4周)复制慢性心力衰竭大鼠模型;将造模成功后的大鼠随机分为模型组、芪苈强心胶囊组(0.3g·kg~(-1)·d~(-1))、当归芍药散低、中、高剂量组(4.3,8.6,17.2g·kg~(-1)·d~(-1)),同时设置正常组,观察大鼠的一般状态及体质量的变化;于给药4周后,采用心脏彩色多普勒超声仪测定各组大鼠左室舒张末内径(left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)、左室收缩末内径(left ventricular end-systolic dimension,LVESD),并计算左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS);麻醉并处死大鼠,取材。HE染色观察心肾病理损伤情况;同时测定24 h尿量、腹水以及脏器指数、含水量等水液代谢指标;全自动生化仪检测大鼠血清生化指标CK、CK-MB、LDH、BUN、SCr含量;试剂盒测定大鼠血清NT-pro BNP水平、NOS活性及NO、c GMP含量;免疫组化法检测大鼠心肌组织中AQP1、AQP4和肾组织中AQP2蛋白分布情况;Western blot法检测大鼠心肌组织中AQP1、AQP4、i NOS和肾组织中AQP2、i NOS蛋白表达情况。第二部分当归芍药散含药血清对ADR诱导的H9C2心肌细胞损伤的改善作用体外培养H9C2细胞株,采用CCK8法筛选诱导剂ADR对H9C2细胞模型的最佳有效时间及浓度和当归芍药散含药血清的最佳作用浓度,通过ADR刺激H9C2细胞,随机分为正常组,ADR组,ADR+L-NAME组,ADR+当归芍药散含药血清低剂量组,ADR+当归芍药散含药血清中剂量组,ADR+当归芍药散含药血清高剂量组;电子显微镜观察H9C2细胞形态变化;试剂盒测定H9C2细胞中CK、LDH水平及NO含量;Western blot检测当归芍药散含药血清及L-NAME对ADR诱导的H9C2细胞HIV-related medical mistrust and PrEP中AQP1、AQP4、i NOS蛋白表达的影响;流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果:第一部分当归芍药散对慢性心力衰竭大鼠水液代谢障碍的影响1.一般情况观察发现,正常组精神状态良好、排便和尿液无异常。模型组大鼠造模2周后出现一定程度的精神萎靡、稀便现象,造模4周后精神萎靡、肛周污物,部分大鼠出现腹水、四肢肿胀及死亡情况。当归芍药散各给药组及芪苈强心胶囊组大鼠精神状态明显好转,食欲增加,死亡率降低。2.体质量测定结果显示,与正常组比较,模型组大鼠在造模2周后体重开始下降,造模第4周心衰症状加重,出现不同程度的腹水,体质量上升,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,当归芍药散各给药组及芪苈强心胶囊组大鼠在给药2周后腹水程度减轻,体质量降低,给药4周后又慢慢回升,以当归芍药散高剂量组和芪苈强心胶囊组为佳,且具有统计学差异(P<0.05)。3.超声心动图结果显示,与正常组比较,模型组大鼠LVESD、LVEDD值显著升高,LVEF、LVFS值均显著降低(P<0.01),且LVEF值<55%;与模型组比较,当归芍药散各给药组及芪苈强心胶囊组LVESD、LVEDD值显著降低,LVEF、LVFS值均显著升高(P<0.01,0.05)。4.腹水量和24 h尿量检测结果显示,与正常组比较,模型组大鼠腹水质量显著增加(P<0.01)、24 h尿量显著减少(P<0.01);与模型组比较,当归芍药散各给药组、芪苈强心胶囊组大鼠腹水质量显著减少(P<0.01),24 h尿量均有增加,以当归芍药散高剂量组和芪苈强心胶囊组增加较为显著。5.脏器质量指数测定结果显示,模型组大鼠心脏、肾脏质量指数显著增加(P<0.01)。与模型组相比,当归芍药散各给药组和芪苈强心胶囊组大鼠心脏、肾脏质量指数均有所降低(P<0.05),以当归芍药散高剂量组较为显著。6.心肌组织HE染色结果显示,正常组大鼠心肌细胞结构完整,周边轮廓清晰可见,无核仁溶解。与正常组相比,模型组大鼠为心肌细胞呈肥大状态,边缘模糊,间质结构紊乱,死亡的细胞增加炎性细胞浸润。相比于模型组,芪苈强心胶囊组和当归芍药散给药组大鼠心肌组织病理损伤上述症状较模型组明显减轻,其中以当归芍药散高剂量组改善效果最佳。7.肾组织HE染色结果显示,正常组大鼠肾小球的结构明显,未见肾小球萎缩,基底膜薄厚一致;与正常组相比,模型组大鼠肾组织结构病变,基底膜厚度增加,伴炎性浸润;与模型组相比,芪苈强心胶囊组和当归芍药散给药组大鼠肾组织病理损伤上述症状较模型组明显减轻,其中以当归芍药散高剂量组改善效果最佳。8.全自动生化分析仪检测结果显示,模型组大鼠血清CK、CK-MB、LDH、BUN、SCr含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,当归芍药散各给药组及芪苈强心胶囊组大鼠血清CK、CK-MB、LDH、BUN、SCr含量显著降低(P<0.01,0.05),以当归芍药散高剂量组和芪苈强心胶囊组较为显著。9.试剂盒检测结果显示,模型组大鼠血清NT-pro BNP水平、NOS活性及NO、c GMP含量显著升高(P<0.01);与模型组相比,当归芍药散各给药组和芪苈强心胶囊组大鼠血清NT-pro BNP水平、NOS活性及NO、c GMP含量显著降低(P<0.01,0.05),以当归芍药散高剂量组和芪苈强心胶囊组较为显著。10.免疫组化结果显示,正常组大鼠心肌组织中AQP1、AQP4及肾脏组织AQP2有微量表达;与正常组相比,模型组大鼠心肌组织AQP1、AQP4及肾脏组织AQP2表达增强;与模型组相比,当归芍药散各给药组和芪苈强心胶囊组大鼠上述病变较模型组明显减轻,其中当归芍药散高剂量组改善效果最佳。11.Western blot结果显示,与正常组相比,模型组大鼠AQP1、AQP4、i NOS蛋白表达量显著增加(P<0.01);与模型组相比,当归芍药散各给药组和芪苈强心胶囊组大鼠AQP1、AQP4、i NOS蛋白表达发生逆转(P<0.01,0.05),其中以当归芍药散高剂量组效果最佳。与正常组相比,模型组大鼠i NOS、AQP2蛋白表达量显著增加(P<0.01);与模型组相比,当归芍药散各给药组和芪苈强心胶囊组大鼠i NOS、AQP2蛋白表达发生逆转(P<0.01,0.05),其中以当归芍药散高剂量组效果最佳。第二部分当归芍药散含药血清对ADR诱导的H9C2心肌细胞损伤的改善作用1.CCK8法检测结果以及显微镜观察结果显示,当ADR溶液浓度为1×10~(-6)mol·L~(-1),干预时间为24 h时,与正常组比较,对心肌细胞具有明显的抑制作用(P<0.01),且细胞形态发生改变,出现明显肿胀。2.CCK8法检测结果显示,与空白组比较,细胞分别经过浓度为5%的当归芍药散含药血清,10%当归芍药散含药血清,15%当归芍药散含药血清,20%当归芍药散含药血清培养24 h后,H9C2细胞在当归芍药散含药血清浓度5%、10%对细胞增殖活力的影响呈浓度依赖,当归芍药散含药血清浓度为15%时,开始出现抑制作用。因此选择10%作为当归芍药散含药血清干预浓度。3.试剂盒检测结果显示,与正常组相比,ADR组细胞CK、LDH水平及NO含量显著升高(P<0.01,0.05);与模型组相比,当归芍药散各含药血清组和ADR+L-NAME组细胞CK、LDH水平及NO含量显著降低(P<0.01,0.05),并呈现呈剂量依赖性。4.与正常组相比,ADR组细胞AQP1、AQP4、i NOS蛋白表达显著增加(P<0.01);与ADR组比较,ADR+L-NAME组与当归芍药散各含药血清组细胞AQP1、AQP4、i NOS蛋白表达量显著降低(P<0.01,0.05),且当归芍药散含药血清给药组的改善效果呈剂量依赖性。5.流式细胞术结果显示,与正常组相比,ADR组心肌细胞的凋亡率显著升高,早期凋亡细胞更明显,具有统计学差异(P<0.01);与ADR组相比,ADR+L-NAME组和当归芍药散含药血清组细胞凋亡率明显降低(P<0.01)。结论:当归芍药散对慢性心力衰竭大鼠有一定的保护作用,对机体心肾损伤、水液代谢障碍具有一定改善作用,可能是阻断NOS/NO/AQPs途径,调节NOS活性及NO的分泌,从而减少i NOS和AQP1、AQP4、AQP2的表达,以维持机体和细胞水液代谢平衡。