烯效唑(Uniconazole)作为植物生长调节剂,广泛应用于小麦、花生等农作物中,对烯效唑的毒理学研究表明,长期使用烯效唑会对人和动物的内分泌产生副作用,存在致畸、致突变的可能,对人类健康构成潜在的风险。针对烯效唑免疫分析方法构建过程中,其检测全抗原的制备主要采用化学合成方法,从而面临效率低、成本高、副产物多、批次误差大等问题。本研究以烯效唑单克隆抗体为靶体,采用噬菌体展示多肽库亲和淘选技术,开展了基于噬菌体展示多肽的烯效唑抗原模拟表位的制备研究;并在此基础上,基于基因工程技术将抗原模拟表位(多肽)分别与麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(Trx A)进行基于原核生物的融合表达,以多肽-融合蛋白的形式替代传统的化学合成的烯效唑检测全抗原,同时开展多肽-融合蛋白(检测全抗原模拟物)在免疫分析层析试纸条的初步应用并初步验证其在均相免疫分析体系中的可行性,取得的主要研究结果如下:1)以烯效唑单克隆抗体为靶标,投入噬菌体随机展示十二肽库,开展了三次、每次三轮的亲和淘选,通过间接Phage-ELISA、间接竞争Phage-ELISA以及DNA测序鉴定,最终从第三次亲和淘选过程中获得了2种烯效唑的抗原模拟表位,分别命名为3-25、3-19,并以其建立Phage-ELISA竞争抑制标准曲线,其半抑制浓度(IC_(50))分别为0.54、0.28 ng/m L,与基于化学合成制备的烯效唑检测抗原所建立的ELISA相比(IC_(50)=3.88 ng/m L),其灵敏度提高了近10倍。2)成功构建了可分别与麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(Trx A)进行融合表达的抗原模拟表位(多肽)-融合蛋白表达载体,分别命名为p MAl-多肽(3-19)-MBP、p MAl-多肽(3-25)-MBP、p ET-多肽surgeon-performed ultrasound(3-25)-Trx A@Spy Tag,将其分别转化至大肠杆菌,通过菌落浓度优化、IPTG浓度优化,实现了多肽(3-19)-MBP、多肽(3-25)-MBP、多肽(3-25)-Trx A@Spy Tag融合蛋白的可溶性表达,其中(3-25)-Trx A@Spy Tag的表达量1L为17.28 mg,多肽(3-19)-MBP、多肽(3-25)-MBP的表达量1L达到9 mg;以生物合成制备的多肽(3-19)-MBP、多肽(3-25)-MBP、多肽(3-25)-Trx A@Spy Tag作为烯效唑全抗原模拟物分别建立竞争ELISA标准曲线,其IC_(50)分别为14.86 ng/m L、3.20 ng/m L、17.34 ng/m L;37℃加速Captisol使用方法保存实验结果表明,在120 h的处理条件下,三种生物合成的烯效唑全抗原模拟物的免疫分析性能均未见显著下降,表明生物合成的烯效唑全抗原模拟物可作为传统化学合成检测抗原的替代物用于免疫分析方法的构建。3)分别将烯效唑抗体与胶体金、乳胶微球、时间分辨荧光微球进行标记,制备信号探针,将烯效唑全抗原模拟物(3-25-Trx A@Spy Tag、3-25-MBP)固定于硝酸纤维素膜的T线,分别构建了基于三种信号模式的烯效唑免疫层析试纸,结果显示:基于胶体金探针的免疫层析试纸无法实现有效地检测,推测可能是胶体金的信号片段无法有效地反应检测信号;基于乳胶微球的免疫层析试纸,当使用3-25-Trx A@Spy Tag作为检测抗原时,其信号灵敏度要强于基于3-25-MBP的免疫层析试纸,其cutoff值为100 ng/m L;以时间分辨荧光微球为检测信号时,以3-25-Trx A@Spy Tag为T线检测抗原的烯效唑免疫层析试纸条的IC_(50)为8.83ng/m L。4)基于Spy Tag/Catcher自组装系统,通过正交实验进行反应温度、反应时间以及Catcher:Spy Tag摩尔比的优化,基于优化后的自组装条件定向制备了偶联有烯效唑全抗原模拟物(3-25-Trx A@Spy Tag)的荧光微球,并与烯效唑抗体免疫磁珠相结合,初步构建了烯效唑的均相免疫分析竞争标准曲线,其SC_(50)值为34.82 ng寻找更多/m L,线性范围为20.05～432.7 ng/m L,实验的结果初步验证了基于全抗原模拟物构建其均相免疫分析方法的可行性,但后续还需进行更深入的研究。