1目的:甲基强的松龙(methylprednisolone,MP)是一种临床常用的糖皮质激素,目前广泛应用于各种免疫介导的疾病如膜性肾病(membranous nephropathy,MN)、Ig A肾病(Ig A nephropathy,Ig AN)、ANCA相关性肾小球肾炎(ANCA-associated glomerulonephritis,AAGN)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)等的治疗。作为炎症因子,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α和白介素(interleukin,IL)-1β在AAGN、Ig AN和LN等的炎症过程中起关键作用。研究表明,MP可通过多种途径抑制TNF-α和IL-1β的释放,从而减轻机体内的炎症反应。MP主要通过基因组效应和非基因组效应来发挥其强大的炎症抑制作用,基因组效应起效时间慢但作用强大;相反,非基因组效应持续时间短且作用较弱。基因组效应是MP发挥其药理作用的主要途径,从基因表达数据库(gene expression omnibus,GEO)中分析得到的MP抗炎生物学信息将作为本研究的基础。巨噬细胞是人体内一种重要的免疫细胞,有多种功能,是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。静息巨噬细胞(M0)会根据不同的微环境极化为经典活化的巨噬细胞(M1)或替代活化的巨噬细胞(M2)表型发挥作用,两种不同表型的巨噬细胞对TNF-α、IL-1β和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)等炎症因子呈现出截然相反的结果。同样,当各种因素导致肾脏微环境发生变化时,肾脏中固有的巨噬细胞也会极化为不同的表型,参与或抑制炎症反应。综上,我们的研究目标是:基于GEO数据库,首先探讨在使用MP 0.25至72小时的16个时间点,对正常大鼠肾脏组织中M1及M2型巨噬细胞相关标志物生物学信息的影响作用;进一步的,以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)建立M1型巨噬细胞的体外模型,研究MP对M0/M1巨噬细胞的表型转换及TNF-α、IL-1β及iNOS表达的影响作用。2方法:2.1分析甲基强的松龙对正常大鼠肾脏中与巨噬细胞分型相关的生物学信息(1)在Array Express(https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress)中,以methylprednisolone和kidney为关键词,检索相关的数据集。(2)筛选标准为MP作用于正常肾脏组织的数据集。(3)筛选到符合研究条件的数据集后,将相关数据导入至GEO数据库中,以GEO2R进行分组、分析,获得正常大鼠在使用MP后0.25至72小时的16个时间点与未使用MP后的全部差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。DEGs定义为:P<0.05,且|log FC(fold change)|>0。(4)利用基因本体论(BIBW2992gene ontology,GO)数据库,对不同时间点DEGs参与的生物过程、M0极化至M1/M2型时的生物学标志物进行分析。利用京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)网站,进行相关的信号通路富集分析。分析过potential bioaccessibility程中,主要关注了MP对正常大鼠肾脏组织中与炎症相关基因的影响作用;在炎症相关的生物学信息中,重点关注了MP是否对M0型巨噬细胞可能极化至M1/M2型时的信息。2.2甲基强的松龙对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞分型的体外作用(1)CCK-8分别确定LPS在0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00μg/m L时、MP在5、10、20、40μM时对RAW264.7小鼠巨噬细胞的毒性。(2)Griess法检测0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00μg/m L的LPS培养RAW264.7细胞4、6、8、12、18、24 h后,培养液中NO的浓度,确定巨噬细胞向M1型极化的最佳LPS浓度及作用时间。(3)将MP分别作用于M0及M1型巨噬细胞,利用PCR及Western Blot检测不同组别中M1型巨噬细胞的标志物TNF-α、iNOS和IL-1β,M2型巨噬细胞的标志物甘露糖受体(mannose receptor 1,CD206)和精氨酸酶1(arginase 1,Arg-1)的m RNA及蛋白的表达变化。(4)收集各组上清液,Elisa检测IL-1β、TNF-α的含量。3结果:3.1甲基强的松龙对正常大鼠肾脏中与巨噬细胞分型相关的DEGs(1)根据筛选标准,共检索到5个数据集。其中题目为“Transcription profiling of rat kidney samples following treatment with the corticosteroid methylprednisolone over several time intervals”的数据集GSE1721纳入本研究。(2)数据集GSE1721中,52只雄性去除肾上腺的Wistar大鼠分为对照组(n=4)及实验组(n=48),实验组48只大鼠随机分成16组(n=3),静脉注射50 mg/kg的MP后,分别于0.25,0.5,0.75,1,2,4,5,5.5,6,7,8,12,18,30,48 and 72小时的16个时间点处死动物,取双侧肾脏进行全RNA收集后进行高通量分析。(3)在72小时的观察时间中,4小时时的DEGs数量最多,为1203个;6小时时其次,为748个;8小时时位列第3,为402个。DEGs的点击此处数量自使用MP0.5小时开始升高,逐渐升高至4小时的峰值后,升高状态持续至12小时,12小时后趋于平稳,至72小时的5个时间点均稳定在300个以下。3.2甲基强的松龙对正常大鼠肾脏中与M1型及M2型标志物的影响对以上DEGs数据及文献分析后,筛选出TNF-α,iNOS,CD68,IL-1β,IL-6为M1型极化的标志物,Arg-1,IL-4,IL-13为M2型极化的标志物。研究中,正常对照组中各基因各时间点的表达均设定为1,与正常对照组相比的结果如下:(1)M1型极化的标志物TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的基因表达倍数最高点出现在使用MP的4个小时内:IL-1β的基因表达在0.5小时时升至19.66倍、IL-6在0.5小时时升至7.89倍、TNF-α在0.5小时时升至1.94倍、iNOS在4小时时升至1.94倍。(2)M1型极化标志物各基因表达倍数最低点出现在使用MP的5.5小时后:TNF-α在5.5小时时降至0.63倍、IL-1β的基因表达在5.5小时时降至0.98倍、IL-6在30小时时降至0.50倍、iNOS在48小时时降至0.60倍。(3)M2型极化的标志物Arg-1、IL-4和IL-13的基因表达倍数最高点出现在使用MP的12个小时之后,升高的倍数均在1.72以下。(4)M2型极化标志物各基因表达倍数最低点出现在使用MP的6小时之内:Arg-1及IL-4在6小时时分别降至0.63倍及0.31倍、IL-13在4小时时降至0.25倍。(5)18小时时,我们关注的TNF-α、IL-1β、iNOS、Arg-1的基因倍数分别为:0.71倍、1.28倍、1.51倍、0.64倍。3.3基于DEGs的GO生物过程研究结果根据DEGs的研究结果,分析4、6、8、12、18、48、72时关于GO生物过程中炎症相关的信息。分析结果显示:(1)“Response to LPS”在4小时时首次出现,在48小时再次出现。(2)与炎症反应相关的信息在6小时时描述为“positive regulation of inflammatory response”,在12小时时描述为“cellular response to IL-1”。(3)4、48、72小时时分别出现“Signal transduction”的描述,且这3个时间点时的P值最低,基因比例最高。(4)“Apoptotic processes”、“negative regulation of apoptotic processes”和“positive regulation of apoptotic processes”的描述,分别出现在MP给药的前8小时内。3.4甲基强的松龙对M0及LPS诱导的M1型巨噬细胞的体外作用结果(1)确定0.5μg/m L、作用18小时为LPS诱导RAW264.7细胞向M1型极化的最佳条件。(2)甲基强的松龙的安全作用浓度为5-20μM,MP作用于RAW264.7细胞2、4、12、18、24、48小时后,Griess法检测细胞上清液中NO的含量,与不加MP的对照组相比,NO含量均没有显著升高(P=ns)。(3)与正常组相比,0.5μg/m L LPS可使TNF-α、iNOS和IL-1β的蛋白及m RNA表达显著增加(P<0.05),Arg-1和CD206的蛋白及m RNA表达显著降低(P<0.05)。(4)与LPS模型组相比,5、10和20μM的MP均可显著降低TNF-α、iNOS和IL-1β的蛋白及m RNA的表达(P<0.05),并且显著增加Arg-1和CD206的蛋白及m RNA的表达(P<0.05)。(5)在细胞培养上清液中,IL-1β、TNF-α在模型组中的含量显著升高(P<0.05),经MP作用后,二者的含量显著降低(P<0.05)。4结论:(1)基于数据集GSE1721的研究显示,使用MP后4小时时大鼠肾脏组织中的DEGs数量最多,12小时至72小时后趋于平稳。(2)随着MP的作用时间,正常大鼠肾脏组织中M1型的标志物TNF-α、iNOS和IL-1β及M2型的标志物Arg-1,IL-4和IL-13的基因表达分别呈现增加或者降低的不同趋势。值得注意的是在MP给药后6小时内,M1型的表达会增加,而M2型的表达会降低。(3)本研究条件下,MP并未呈现出诱导RAW.264.7巨噬细胞从M0型向M1型转化的作用。(4)对于LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞,MP可显著降低TNF-α、iNOS和IL-1β的m RNA和蛋白表达、显著增加Arg-1和CD206的m RNA和蛋白表达,同时MP具有显著抑制M1型巨噬细胞产生TNF-α及IL-1β的作用。以上结果出现在MP作用于M1型18小时时。(5)综上,我们的研究结论如下:首先,以上MP对M0基因表达谱与相应的体外研究的结果并不一致。基因表达谱显示MP给药后6小时内M1型的表达会增加,M2的表达会降低,但体外研究显示MP并不具有诱导M0向M1型极化的作用。其次,MP可抑制LPS诱导的M1型产生TNF-α及IL-1β,该作用与MP调节M1/M2分型的作用相关。