库布病毒(Kobuvirus,Ko V)属于小RNA病毒科库布病毒属的成员,它所引起的感染为国内新发的传染病,临床上以腹泻为特征,给人和动物健康造成危害。目前有关该病的诊断、防治及病毒致病机理等方面缺乏研究。本研究根据实验室从病牛体内确定的国内首株D种库布病毒株的核苷酸基因组序列,应用RT-PCR技术扩增出L蛋白基因片段,并将其克隆到原核表达载体中,成功构建重组质粒p GEX-4T-1-Ko V-L,通过大肠杆菌表达系统诱导表达重组GST-L蛋白,以纯化的重组蛋白作为免疫原,与弗式佐剂混合乳化后免疫实验动物,制备针对L蛋白的鼠源单克隆抗体和兔源多克隆抗体。采集血清效价较高的小鼠脾细胞与Sp2/0细胞进行融合,经过筛选和4次亚克隆获得3株能够稳定分泌抗L蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。单克隆抗体亚型鉴定结果显示,3F3和4G10单抗的亚型为Ig G1,4F5单抗亚型为Ig G2a。特异性和稳定性试验结果表明,经冻存后复苏和连续传代后,获得的3株杂交瘤细胞的抗体效价基本无差异,且抗体水平稳定,产生的单克隆抗体均可以特异性检出D种库布病毒抗原。利用蛋白截短技术与Western blot方法初步确定出3株单抗识别的抗原表位区域,通过肽扫描法和间接ELISA方法,进一步确定出3F3、4F5和4G10单克隆抗体的抗原表位分别为L蛋白氨基酸序列中的~(97)RICAKTLPGPWHS~(107)、~(105)GPWHSKLTKAERIF~(118)、~(13)ERPFHYSLPKPSS~(25)区段。将3株鼠源抗L蛋白单克隆抗体与兔源抗L蛋白多克隆抗体两两组合,初步建立多种检测D种库布病毒抗原的夹心ELISA方法,结果显示,以鼠源单克隆抗体4G10作为捕获抗体,兔源多克隆抗体为检测抗体时,检测效果最佳;优化条件后的夹心ELISA方案为:捕获抗体包被量为200 ng/孔,检测抗体的最佳稀释度为1:4000,酶标二抗稀释浓度为1:5000,判定标准为被检测牛粪便样品OD_(490)≥0.191时,结果判定为阳性。该方法检测牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒样品均呈阴性,具有较强的selleck化学特异性;D种库布病毒阳性粪样稀释160倍后,以夹心ELISA方法检测结果仍为阳性,与RT-PCR方法检测结果一致,具有较高的敏感性;板内变异系数为3.4%～6.2%,板间的变异系数为2.7%～7.5%,夹心ELISA方法重复性良host genetics好。应用建立的检测方法对长春和新疆部分地区的457份牛粪进行检测,结果发现上述地区的牛群存在程度不同的D种库布病毒感染,牛群D种库布病毒的感染率为8.24%～32.50%。综上所述,本研究制备了抗D种库布病毒的单克隆抗体,确定出其抗原表位,为诊断方法建立、致病机制以及L蛋白功能的研究打下基础;以制备的单克隆抗体为捕获抗体,兔源多克隆抗体为检测抗体,首次建立并初步应用了特异敏感的检测D种库布病毒抗原的双抗体夹Raf抑制剂心ELISA方法,发现长春和新疆部分地区存在程度不同的D种库布病毒感染。本研究结果为今后D种库布病毒感染的诊断、检疫及防控提供了有效的技术手段和流行病学理论依据。