研究背景:炎症失调涉及多种急慢性疾病的复杂病理过程,过度的炎症常引起组织损伤,这种情况下,炎症会引发并推动各种疾病的发生和进展,如癌症、心血管疾病和代谢性疾病等,这些疾病占全球死亡总人数的70%。抗炎治疗对提高患者生存率和生活质量至关重要。传统抗炎治疗药物具有潜在副作用、起Crude oil biodegradation效缓慢或缺乏疗效等缺点,可能由于生物利用度差,或全身给药后的脱靶效应造成。因此,应该开发更加先进的给药策略来改善药物的靶向性和减少有害的生物学效应。研究发现代谢物乳酸及其传导的信号通路可以通过调控巨噬细胞的功能来抑制炎症,且无毒副作用。然而乳酸作为一种代谢性极强的代谢物及其亲水性和酸性等特性,药物供体和给药途径是个难题。因此需要找到一种合理的给药系统,将乳酸释放到所需的区域。近年来研究发现免疫细胞来源的细胞外囊泡具有天然的炎症靶向能力,作为药物传递系统具有强大的优越性。另外,疏水性的丙交酯是一种生态友好的无毒化合物,在体内分解后释放乳酸,可以作为乳酸的药物供体,因此,在这项研究中,我们利用巨噬细胞来源的凋亡小体具有其亲本细胞的炎症趋化特性和凋亡小体特有的天然被活化的巨噬细胞吞噬的原理,设计了一种具有凋亡小体天然膜功能的纳米颗粒传递系统,将包含有乳酸供体的纳米颗粒靶向输送至炎症部位并缓慢释放乳酸,调控炎症微环境中巨噬细胞的功能,改善小鼠的炎症及损伤。研究方法:首先提取巨噬细胞来源的凋亡小体(Apoptotic bodies,ABs)并获取凋亡小体膜(Membrane of apoptotic bodies,ABm),通过一系列方法进行表征和鉴定;然后制备凋亡小体膜包被的纳米颗粒(Apoptosis body-encapsulated nanoparticles,ABNs)并进行表征和验证,包括形态、大小、融合度、膜蛋白的表达情况及生物稳定性的测定。评价ABNs在体内外的乳酸释放量及ABNs在体内外的安全性。观察体外巨噬细胞对ABNs的特异性摄取及ABNs的体外抗炎作用:在体外将活化的RAW264.7细胞和ABNs共孵育,通过荧光显微镜观察巨噬细胞对药物的特异性摄取。在体外将ABNs和RAW264.7巨噬细胞共培养,一定时间后检测巨噬细胞活性氧和炎症蛋白水平以及上清液中炎症因子的表达;通过显微镜观察巨噬细胞的形态变化,免疫荧光染色检测巨噬细胞M1和M2标志蛋白的分布,WB检测CD86、i NOS、CD206和Arg1的表达。ABNs的体内炎症靶向性和抗炎效果的验证:构建葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠急性结肠炎模型,评估ABNs在体内的炎症部位靶向能力和炎症肠组织巨噬细胞对ABNs的吞噬能力。ABNs治疗后,观察并记录小鼠体重和DAI的变化,观察结肠组织的炎症情况,免疫组化方法检测肠粘膜紧密连接蛋白的表达;通过WB方法检测肠组织TLR4/NF-κB的蛋白表达和ELISA方法检测血清炎症因子的水平。通过免疫荧光染色技术和WB方法检测结肠组织巨噬细胞的表型转化。再次验证ABNs对体内炎症的治疗作用和机制:构建脂多糖和D-半乳糖胺诱导的小鼠急性肝炎模型。检测ABNs在体内的炎症部位靶向能力和肝脏组织中的巨噬细胞对ABNs的特异性吞噬能力。ABNs治疗后,观察并记录小鼠的体重变化;检测血清炎症因子、肝脏组织的炎症情况、肝细胞凋亡水平以及TLR4/NF-κB蛋白的表达水平;通过免疫荧光染色和WB方法检测肝脏组织中巨噬细胞的表型转化。研究结果:1.ABNs的特性及体外抗炎效果和对巨噬细胞的影响:ABNs保持了天然ABs的形态及相似的蛋白表达,具有良好的生物稳定性。在体外可以持续释放乳酸并且在体内不影响小鼠血清的乳酸浓度;ABNs可LXH254以被体外活化的巨噬细胞特异性摄取,摄取量随着时间和浓度的增加而增加;ABNs组中巨噬细胞ROS及炎症信号蛋白表达水平明显降低,24h后上清液TNF-α和IL-1β水平明显降低,TGF-β和IL-10水平明显升高。加入ABNs后,M1巨噬细胞形态伸长成细长状,并且在24-36h显著增多。M2标记CD206和Arg1的表达显著升高,并且随着时间而增加,而M1标志物CD86和i NOS的表达逐渐降低。2.ABNs在结肠炎小鼠模型中的抗炎效果和对炎症微环境中巨噬细胞的影响:ABNs在体内具有结肠炎症部位的靶向能力,并在体内被活化的巨噬细胞特异性摄取;ABNs组小鼠体重恢复最快,DAI评分最低,ABNs缓解结肠炎组织的炎症及水肿,增加肠道紧密连接蛋白的表达;ABNs可降低结肠炎小鼠血清炎症因子TNF-α和IL-1β的表达,抑制炎症信号TLR4/NF-κB蛋白的表达;免疫荧光图像显示,ABNs促进了肠组织中M1巨噬细胞(CD86+)向M2表型(CD206+)的转化;ABNs组CD86和i NOS的表达水平降低,而CD206和Arg-1的表达水平显著升高。3.ABNs对肝炎小鼠的治疗作用和对炎症部位巨噬细胞的影响:ABNs在体内具有肝脏炎症部位靶向能力,并被炎症微环境中的巨噬细胞特异性摄取;ABNs组中肝组织炎症及出血坏死明显减少,凋亡水平明显减轻;ABNs减少血清促炎因子TNF-α和IL-1β的表达,抑制肝组织TLR4/NF-κB蛋白的表达;免疫荧光显示ABNs促进了肝组织中M1巨噬细胞(CD86+)向M2表型(CD206+)的转化;WB分析显示ABNs组CD86和i NOS的表达水平降低,而CD206和Arg-1的表达水平显著升高。4.ABNs的体内外安全性:细胞毒性检测发现ABNs在一定剂量范围内对巨噬细胞无明显的细胞毒性作用。在体内安全性方面LY294002体内,正常小鼠静脉给药后,体重、血液学及主要组织器官未见明显损伤。研究结论:我们利用巨噬细胞来源的凋亡小体作为天然给药系统,丙交酯作为乳酸供体,设计了一种具有双靶向性的天然膜功能的纳米颗粒药物传递系统,通过乳酸的局部释放来调控巨噬细胞向稳态功能的转化,抑制炎症信号的诱导,减少ROS和炎症蛋白的产生,改善炎症及损伤,且没有毒副作用;通过包裹凋亡小体天然膜,对炎症部位和巨噬细胞的双靶向性功能明显增强。我们的研究表明,该纳米系统可以作为一个很有前景的抗炎治疗策略,通过调控炎症微环境免疫细胞的功能来缓解炎症引起的损伤,实现低毒高效的抗炎治疗作用。