O-连N-乙酰葡萄糖胺(O-linked N-acetylglucosamine,O-Glc NAc)修饰是一种广泛存在于细胞核质蛋白上的可逆性翻译后修饰形式。O-Glc NAc糖基转移酶(O-Glc NAc transferase,OGT)以尿苷二磷酸N-乙酰葡糖胺(Uridine diphosphate N-acetylglucosamine,UDP-Glc NAc)为糖供体,将单个Glc NAc糖基转移到蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上,而糖苷酶(O-Glc NAcase,OGA)则负责O-Glc NAc修饰中的糖苷键水解。O-Glc NAc糖基化修饰在细胞应激反应、基因调节、更多信号转导等多种生命活动进程中发挥着重要的作用。研究表明,OGT表达及O-Glc NAc糖基化水平的失调与癌症的发生、发展密切相关,OGT/O-Glc NAc修饰已经成为肿瘤治疗的一个潜在靶点。然而,现有OGT抑制剂依然存在亲和力低、特异性差、体内活性不佳等挑战,尚难以满足以OGT/O-Glc NAc为靶点的抗肿瘤研究。本文基于OGT对底物多肽序列的高度选择性,利用分子动力学模拟手段对ZO3S1多肽(YDIYRVPSSQS)与OGT的动态相互作用进行了深入地分析和优化,并设计和合成了基于伪底物策略的OGT多肽抑制剂,初步评估了其体外抗肿瘤活性。其主要研究内容和结论如下:(1)OGT-多肽底物的分子动力学模拟及突变改造。通过分子动力学模拟证明,OGT的H509残基与底物多肽ZO3S1的S15残基间的动态相互作用是两者稳定结合的不利因素;OGT酶活性分析表明,S15位点突变形成的ZO3SM(S15A)底物多肽的OGT酶活性是对照野生型多肽ZO3S2的1.7倍。(2)OGT伪底物抑制剂的制备。通过Fmoc多肽固相合成法,制备了OGT伪底物多肽抑制剂ZO3-I1(RVPSAQS)和ZO3-I2(RVPSAQA),以及N端含有穿膜序列的OGT伪底物抑制ZO3-I3(RRRRRVPSAQS)和ZO3-I4(RRRRRVPSAQA)。(3)OGT伪底物抑制剂的抑制活性表征。OGT酶活性抑制实验表明,ZO3-I1对重组OGT酶活性的抑制IC_(50)为317.7μmol·L~(-1),ZO3-I2为192.9μmol·L~(-1);O-Glc NAc免疫印记实验证明,无N端穿膜序列的ZO3-I2仅在浓度达200μmoBiomedical image processingl·L~(-1)时能轻微地降低HCT116和Lo Vo细胞内的O-Glc NAc糖基化水平,而含有穿膜序列的ZO3-I4在20μmol·L~(-1)浓度下即可显著下调或抑制两种细胞内的O-Glc NAc水平,并且呈现浓度依赖效应;而ZO3-I1和ZO3-I3对HCT116细胞内的O-Glc NAc水平无显著影响。(4)OGT伪底物抑制剂的抗肿瘤活性研究。细胞迁移实验表明,ZO3-I4在100μmol·L~(-1)浓度下可显著抑制HCT116细胞的迁移并呈现浓度依赖效应;细胞毒性实验和克隆形成实验表明,ZO3-I4能够提高HCT116细胞对Dox的药物敏感性,与Dox单独处理组相比细胞存活率下降了10%左右;同时,蛋白免疫印迹和流式细胞术证明,ZO3-I4可以促进Dox诱导的促凋亡因子BAX点击此处水平的上升,使Dox诱导的细胞凋亡率提升了1.65%。