研TB and other respiratory infections究背景:脓毒症和病原微生物感染引起的中枢神经系统(Central nervous system,CNS)功能障碍与血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)通透性增加密切相关。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性菌AY-22989溶解度细胞壁更多的一种免疫原性成分,被广泛用于建立脓毒症相关脑病(Sepsis associated encephalopathy,SAE)的模型。咪达唑仑是一种作用于苯二氮(?)类受体的镇静剂,广泛用于临床上的各种镇静和癫痫急性发作,最近的研究报道其可以通过抑制免疫炎症反应发挥神经保护作用。但其在LPS引起的BBB功能障碍中的作用尚不清楚,本研究旨在探讨咪达唑仑对LPS诱导的BBB损伤是否具有保护作用,以及其可能的机制。研究目的:(1)研究咪达唑仑对内毒素血症小鼠血脑屏障功能的保护作用。(2)探讨咪达唑仑改善LPS引起的人脑微血管内皮细胞(Brain microvessel endothelial cells,HBMECs)通透性的作用和机制。研究方法:(1)腹腔注射1mg/kg LPS构建BBB损伤模型,并通过腹腔注射1mg/kg和2mg/kg浓度的咪达唑仑进行干预。采用氧化应激检测、ELISA、伊文思蓝、RT-qPCR、免疫荧光实验分别检测咪达唑仑对小鼠大脑皮层大脑皮层丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、血清IL-6、IL-1β和MCP-1炎症因子水平、脑组织伊文思蓝渗出率、紧密连接蛋白1(Zonula occludens-1,ZO-1)的mRNA和蛋白水平的影响。(2)构建 LPS 刺激 HBMECs模型。利用 Elisa 和 RT-qPCR、TEER、FITC-Dextran、Western blot实验检测咪达唑仑对HBMECs炎症因子的mRNA和蛋白水平、跨内皮细胞电阻、内皮细胞通透性、ZO-1、RhoA和Rock2蛋白表达水平的影响。(3)构建过表达RhoA的HBMECs。采用Western blot、FITC-Dextran实验评估RhoA过表达效率和对咪达唑仑改善HBMECs中ZO-1蛋白表达、单层内皮细胞通透性的调控作用。研究结果:(1)LPS引起大脑皮层MDA增加,SOD水平下降,1mg/kg和2mg/kg咪达唑仑干预可减少大脑皮层的以上改变,减弱大脑皮层氧化应激。(2)LPS引起小鼠血清炎症因子IL-6、IL-1β和MCP-1水平急剧增加,与LPS组比,咪达唑仑组血清炎症因子IL-6、IL-1β和MCP-1水平显著下降。(3)LPS组小鼠伊文思蓝透过率增加,咪达唑仑减少LPS组小鼠伊文思蓝透过率,减弱LPS导致的BBB通透性改变。(4)LPS组小鼠大脑皮层ZO-1的表达下调,咪达唑仑部分逆转ZO-1的表达下调。(5)咪达唑仑抑制LPS诱导HBMECs促炎介质分泌增加。(6)咪达唑仑改善LPS引起的HBMECs中TEER的减少和内皮细胞通透性的增加。(7)咪达唑仑改善LPS引起的HBMECs ZO-1的表达。(8)咪达唑仑改善LPS引起的HBMECs中RhoA和Rock2蛋白水平增加,过表达RhoA可抵消咪达唑仑增加ZO-1的表达以及改善内皮细胞的通透性等作用。研究结论:咪达唑仑改善LPS引起的小鼠BBB通透性增加和功能损伤,改善LPS刺激的HBMECs通透性改变及损伤,其可能的机制与抑制RhoA/ROCK2通路有关。