咖啡因的使用在我们日常生活中越来越常见,比如在饮料、化妆品和临床用药中皆随处可见。咖啡因与人类健康息息相关,其主要功能是作为高效的腺苷受体拮抗剂,能快速兴奋中枢神经系统,因此它与神经系统疾病关系密切。既往的一些研究发现了咖啡因的使用会加重已经发生的听力下降,暗示了咖啡因的听力损害作用。但目前尚不清楚咖啡因影响听力下降的主要机制。首先,我们利用C57BL/6小鼠模型比较了不同咖啡因处理前后听性脑干反应、Corti器、血管纹和螺旋神经元的差异。然后对不同实验组进行RNA-Seq测序,分析了小鼠耳蜗样本中的mRNA的表达差异。在耳蜗样本中用qRT-PCR和Western blotting方法验证RNA-Seq的部分结果,找出在这一变化过程中可能起作用的差异基因。接着我们利用HEI-OC1细胞系来进行体外实验的验证。先用CCK-8实验NSC 119875化学结构绘制出咖啡因的浓度时间曲线,以挑选合适的实验浓度范围。然后利用流式细胞仪、TUNEL染色、免疫荧光染色、qRT-PCR和Western blotting等方法检测差异基因对HEI-OC1细胞影响及其主要影响的通路。最后利用基底膜体外培养模型更多进一步观察咖啡因对毛细胞的直接作用。动物模型的体内研究表明,120 mg/kg腹腔注射咖啡因会通过损害Corti器和螺旋神经节神经元而导致小鼠听力下降,小剂量的咖啡因对听力无明显的损害作用。RNA-Seq结果提示SGK1基因可能在咖啡因导致的耳毒性过程中起关键作用,同时还发现咖啡因的使用直接导致耳蜗的自噬及凋亡水平升高。体外细胞实验也证实了同样的结果,流式细胞仪凋亡检测、TUNEL染色实验、免疫荧光染色实验、qRT-PCR实验和Western blotting实验结果表明,咖啡因是通过SGK1途径诱导了细胞的自噬和凋亡。我们通过co-IP实验验证了 SGK1和HIF-1α之间可能存在相互作用。为了证实SGK1和HIF-1α的作用,我们分别加入了 GSK650394(SGK1抑Medicinal earths制剂)和CoCl2(HIF-1α诱导剂)来进行调控观察。Western blotting结果发现,GSK650394可以抑制HIF-1α的表达,但加入CoCl2后SGK1的表达量未见明显变化,GSK650394和CoCl2都可减轻咖啡因诱导的细胞凋亡和自噬。将咖啡因直接作用于基底膜体外培养模型时,我们发现咖啡因主要损害的是乳鼠耳蜗基底膜的内毛细胞。综上所述,这些结果表明咖啡因通过SGK1/HIF-1α通路诱导听觉毛细胞自噬和凋亡,提示大剂量的咖啡因可能导致听力损失。此外,我们的发现为耳毒性药物提供了新的见解,同时也揭示了 SGK1及其下游通路可能是分子水平上听力研究的潜在治疗靶点。