巴贝斯虫病是由巴贝斯虫寄生于宿主动物的红细胞内引起的寄生原虫病,其寄生宿主种类多样。吉氏巴贝斯虫主要感染犬类动物,引起犬只出现贫血、黄疸、血红蛋白尿等症状甚至导致死亡,对于世界范围内伴侣动物犬的危害十分严重。面对吉氏巴贝斯虫病发病率高、分布范围广、药物治疗效果差及耐药性频发的困境,目前尚未出现可以从根本上治疗或预防吉氏巴贝斯虫感染的商品化疫苗和药物。巴贝斯虫属于顶复门原虫,经全基因组测序显示,大部分顶复门原虫中缺乏传统的三羧酸循环必需酶,可能主要经糖酵解和无氧糖代谢途径产生ATP和乳酸。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和CO_2反应生成草酰乙酸(OAA),此反应是吉氏巴贝斯虫产生草酰乙酸、固定CO_2、合成氨甲酰磷酸和嘧啶、回收嘌呤以及生成糖酵解中间产物的重要途径。人体及动物基因组中不存在PEPC,但却可以在巴贝斯虫基因组中鉴定到编码selleckchem IDN-6556PEPC的基因,这表明PEPC在寄生虫中可能有特异的功能。对于PEPC的深入研究有助于阐明虫体的能量代谢机制,为药物作用靶标的挖掘提供基础数据。本研究以吉氏巴贝斯虫PEPC为研究对象,通过探究PEPC的生物学信息,以基因编辑的方式破坏吉氏巴贝斯虫PEPC的表达,从而减少下游代谢产物的产生,探究PEPC基因敲除对吉氏巴贝斯虫生长的一系列影响。主要结果如下:以吉氏巴贝斯虫g DNA和c DNA为模板扩增PEPC基因,得到基因全长为3255bp,含8段内含子,编码958个氨基酸。该蛋白无跨膜结构和信号肽序列,与疟原虫等原虫类蛋白的相似性较高,而与植物和细菌等物种的相似性较低。本研究构建了BgPEPC-3x Flag定位虫株,经Western blot实验得出BgPEPC蛋白的天然大小为105 k Da,经IFA实验证实PEPC蛋白定位于虫体胞质中。本研究在BgPEPC-3x Flag虫株和WT虫株的基础上进行PEPC基因的敲除,多次尝试后均未在常规培养基的条件下得到敲除虫株。通过在培养基中添加对虫株生长无抑制作用的5 m M下游代谢产物苹果酸,获得基因缺失虫株。本研究通过比较△BgPEPC虫株、BgPEPC-3x Flag虫株、WT虫株的生长速率,发现基因缺失虫株的生长速率明显低NK cell biology于对照虫株,证明PEPC对于虫体的正常生长和下游代谢物的产生发挥着重要的作用。基因缺失虫株在普通培养基中能维持低速率的生长,证明寄生虫体内存在着PEPC基因发挥作用的替代途径或者虫体可从宿主红细胞、培养基内获取物质以弥补基因缺失带来的不利影响。实验确定了苹果酸的最佳添加浓度为1 m M,补充后虽然不能完全达到对照虫株的生长速率,但可部分selleckchem逆转其生长缺陷。另外,PEPC基因的敲除对虫体的生长形态以及红细胞内不同虫体数量的占比也有一定的影响,对照虫株中的四分体比例以及单个虫体的比例明显高于基因缺失虫株。为进一步探究PEPC缺失对TCA循环的影响,本研究选取了六种下游代谢物作为外源添加物,实验发现,仅在培养基中补充苹果酸可以回补基因缺失虫株的生长。为探究基因缺失虫株的存活机制,本研究测定了天冬氨酸氨基转移酶和线粒体能量代谢过程的代谢抑制剂L-环丝氨酸和三氮脒的IC_(50)值,结果表明基因缺失虫株对两种药物的IC_(50)值均明显小于对照虫株,且补充苹果酸后对L-环丝氨酸的敏感性降低,而对三氮脒的敏感性无显著影响,表明PEPC的缺失使吉氏巴贝斯虫对这两种抑制剂的敏感性增加,且仅补充苹果酸无法挽救三氮脒对虫体的抑制作用。综上所述,本研究通过生物学信息分析对吉氏巴贝斯虫PEPC进行鉴定,通过构建定位虫株确定其定位于虫体胞质,在定位虫株的基础上进一步了构建基因缺失虫株,通过表型实验、回补实验和抑制剂敏感性实验等,分析BgPEPC基因的缺失对于吉氏巴贝斯虫生长的影响。本研究通过探索巴贝斯虫糖代谢关键酶PEPC的生物学功能,为抗吉氏巴贝斯虫的药物靶点研究与新型抗寄生虫药物开发提供理论基础。