口蹄疫(foot-and-mouth disease)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus)引起的一种急性、高度接触性传染病。口蹄疫每年给世界各国造成了巨大的经济损失和社会影响。深入研究病原的流行特征及病毒与宿主互作的分子机制,将为口蹄疫的防控和疫苗研发提供理论基础。我们研究发现,口蹄疫病毒感染可诱导宿主细胞HDAC8蛋白的降解,进一步研究表明口蹄疫病毒结构蛋白VP3结合并促进HDAC8通过自噬途径降解。本研究探究了口蹄疫病毒利用自身结构蛋白VP3拮抗宿主天然免疫反应的新机制,主要结果如下。(一)HDAC8抑制口蹄疫病毒的复制为探究组蛋白去乙酰化酶是否调控口蹄疫病毒的复制,首先使用组蛋白去乙酰化酶通用抑制剂,Ⅰ类组蛋白去乙酰化酶抑制剂以及组蛋白去乙酰化酶8特异性抑制剂处理。结果表明:在不同细胞系中,与对照组相比抑制剂处理细胞后口蹄疫病毒呈现不同程度的增加且HDAC8特异性抑制剂效果最为明显。为进一步探究HDAC8对口蹄疫病毒复制的影响,利用CRISPR/Cas9技术分别构建HDAC8基因敲除的BHK-21和PK-15细胞系。感染病毒后,从转录水平、蛋白水平以及病毒滴度三个维度证明,与对照细胞系相比,HDAC8敲除能显著促进口蹄疫病毒的复制。为进一步验证HDAC8的功能,在PK-15细胞中过量表达HDAC8,结果表明,与对照相比,过量表达HDAC8可显著抑制口蹄疫病毒的复制。(二)口蹄疫病毒感染降低HDAC8蛋白的表达但对其转录无显著影响为探究口蹄疫病毒感染对HDAC8蛋白表达和转录水平的影响,将细胞接种于6孔板内并感染口蹄疫病毒,分别在0 h、1 h、3 h、5 h、7 h、9 h收取样品。结果表明,口蹄疫病毒感染不影响HDAC8 m RNA的转录,但可显著降低HDAC8蛋白的表达且具有时间依赖性。为进一步探究不同MOI口蹄疫病毒对HDAC8蛋白表达的影响,分别以0、0.01 MOI、0.05 MOI、0.10 MOI、0.25 MOI口蹄疫病毒感染细胞并在病毒感染8 h后收取样品。结果表明,随着口蹄疫病毒感Small biopsy染剂量的增加HDAC8蛋白表达显著降低且具有剂量依赖性,但HDAC8转录无显著变化。(三)HDAC8正调控先天性免疫信号通路为探究HDAC8是否参与调控先天性免疫信号通路,利用PK-15-KOHDAC8敲除细胞系和对照细胞系以0.1个MOI感染口蹄疫病毒8 h后收取样品。结果显示,敲除HDAC8蛋白后TBK1和IRF3的磷酸化显著降低,过量表达HDAC8显著促进表明TBK1和IRF3的磷酸化。转录水平显示,敲除HDAC8显著抑制IFN、OAS、ISG54、CCL5、TNF-α的表达水平且过量表达HDAC8后IFN、OAS、ISG54、CCL5、TNF-α的转录水平显著增加。表明HDAC8正调控先天性免疫信号通路且HDAC8可通过调控先天性免疫应答抑制口蹄疫病毒复制。(四)VP3蛋白结合并通过AKT-m TOR-ATG5信号通路诱导HDAC8的降解口蹄疫病毒包含4个结构蛋白和8个非结构蛋白,为筛选降解HDAC8的病毒蛋白,将口蹄疫病毒结构蛋白或非结构蛋白质粒与对照组质粒转染PK-15细胞,24 h后收取蛋白样品。结果表明结构蛋白VP3与非结构蛋白3C~(pro)降解HDAC8蛋白水平的表达最为显著。因3C~(pro)是一种蛋白水解酶可水解多种宿主因子,故本研究将主要聚焦于VP3蛋白的功能研究。为进一步探究不同口蹄疫病毒毒株VP3蛋白是否具有降解HDAC8的作用,将O型、A型和亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP3蛋白梯度转染或与HA-HDAC8质粒共转PK-15细胞。结果表明不同毒株口蹄疫病毒均梯度降解内源或外源HDAC8蛋白的表达。另外,为探究VP3蛋白与HDAC8是否存在相互作用以及共定位,将FLAG-VP3质粒和HA-HDAC8质以及对照质粒分别转染2粒93T细胞或PK-15细胞。蛋白互作试验表明VP3与HDAC8存在相互作用及共定位。为进一步探究VP3蛋白降解或与HDAC8相互作用的区域,将VP3截断质粒与HA-HDAC8共转PK-15细胞或293T细胞。结果表明VP3蛋白315-465段和466-660段显著降解HDAC8蛋白水平的表达,316-465段与HDAC8蛋白存在蛋白互作。为探究口蹄疫病毒感染降解HDAC8的途径,不同蛋白降解途径的抑制剂加入到共转FLAG-VP3及HA-HD购买MK-4827AC8的PK-15细胞中。结果表明自噬途径抑制剂CQ和3-MA显著回复VP3蛋白对HDAC8的降解。为进一步探究VP3蛋白是否诱导细胞自噬的产生,将对照质粒和VP3质粒转染PK-15细胞。分别从LC3B-Ⅱ蛋白水平显著增加,免疫selleck合成荧光水平LC3B呈现显著点状聚集以及透射电镜水平呈现明显双层膜结构三个维度证明VP3蛋白诱导细胞自噬的产生。LC3和P62是自噬发生的两个标志性蛋白,本研究发现VP3蛋白与LC3和P62均存在蛋白相互作用和共定位。为进一步探究VP3蛋白诱导HDAC8自噬降解的分子机制,将对照质粒和VP3质粒转染PK-15细胞。结果显示,与对照相比磷酸化的AKT和m TOR的表达显著降低,表明VP3蛋白可通过AKT-m TOR信号通路诱导自噬的产生。SC79是一种AKT特异性激活剂,其可通过抑制AKT的膜穿梭影响AKT的表达。SC79处理后以剂量依赖的方式回复HDAC8和AKT的表达进而抑制VP3诱导的自噬。ATG5是自噬发生的关键节点分子,利用ATG5敲除细胞系转染VP3质粒发现VP3蛋白在ATG5敲除细胞系中不能诱导细胞自噬的发生且不能降解HDAC8蛋白。综上所述,本研究首次阐述了HDAC8通过调控先天性免疫信号通路的转导和Ⅰ型干扰素的产生抑制口蹄疫病毒的复制。为抵御这种影响,口蹄疫病毒利用自噬途径促进HDAC8的降解。进一步研究表明口蹄疫病毒结构蛋白VP3与HDAC8存在相互作用并通过AKT-m TOR-ATG5通路诱导自噬降解HDAC8。口蹄疫病毒通过自噬降解调控先天性免疫应答的蛋白并演化出拮抗宿主抗病毒应答的策略,为口蹄疫病毒的致病机制和防控提供了新的参考。