DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰,在多种生物学过程中发挥关键作用,如X染色体失活、基因表达、胚胎发育、基因组印记、癌症的发生发展等。胚胎干细胞是一类具有无限自我更新能力及分化潜能的多能干细胞,已有研究表明DNA甲基化与胚胎干细胞的多能性及分化能力密切相关。亚硫酸氢盐测序是检测DNA甲基化的金标准。然而,在重亚硫酸盐转化过程中,DNA双链会打开并分离,数据分析难以明确同一条DNA来源的两条链的甲基化状态。为了分析细胞中DNA两条链甲基化的对称性,本研究参考购买AG-221已有文献建立了发卡-全基因组甲基化测序(Hairpin whole genome bisulfite sequencing,HPWGBS)体系,利用发卡接头将DNA的正负链连接在一起,测序得到来源于同一条DNA双链的两条链的甲基化状态。本研究首先对亚硫酸氢盐转化的效率进行了检测,结果表明在亚硫酸氢盐浓度为0.5×,BS转化时间为9 h时,转化效率最高。本研究优化了发卡接头和测序接头的比例,使发卡接头的连接效率达到较高水平。扩增后的文库经过磁珠纯化和琼脂糖凝胶电泳分离,使得到的产物中发卡接头的连接效率达到90%以上。为了研究胚胎干细胞中DNA半甲基化的状态,分别使用超声打断和酶法打断获得的DNA进行HPWGBS建库,测序得到100G的数据。分析发现发卡接头的连接效率为91%,基因组比对效率为78%以上。Cp G位点的总体覆盖为95%,其中大于70%的Cp G测了5次以上,表明该体系比较完整地检测了基因组中的Cp G位点。对双链的DNA甲基化水平进行分析,结果表明胚胎干细胞中的全甲基化水平为26.30%,正链甲基化水平为7.82%,负链的甲基化水平为7.74%。在ESCs分化过程中,伴随着多能性基因和胚层分化相关基因的甲基化状态的调整。为了从单细胞水平明确ESCs分化过程中特定基因调控区域(主要为Cp G岛)甲基化状态的变化模式,研究根据多能性基因(如Fut4、Prmt5、Vgll4)和三胚层标志基因(如Tubb3、Meis1、Pdgfra、Bmp4、Hand1、Gata6、Klf5、Sox17、Foxa2、Gsc、CxcHepatic organoidsr4)的Cp G岛序列设计了用于重亚硫酸盐-PCR的引物。收集ESCs拟胚体分化和原始态-始发态(NPT)分化过程中的样品,提取基因组DNA,进行重亚硫酸盐转化后用于BS-PCR。每个样品的PCR产物等摩尔寻找更多混合后进行酶法打断成300 bp左右的片段,连接测序接头进行文库构建,以同时检测同一样品中多个靶标区域的DNA甲基化状态。目前,本研究可以实现多对引物同时放入反应体系进行BS PCR。综上所述,本研究1)建立并优化了HPWGBS体系,并用于研究ESCs中DNA半甲基化的分布情况,2)解析了ESCs随机分化和NPT过程中多能性和分化相关基因Cp G岛甲基化的转变模式。因此,为研究多种细胞、组织中DNA半甲基化的分布和功能提供了技术手段,为进一步理解ESCs多能性退出或者转变过程中的调控机制提供了参考。