缺血性心脏病(Ischemiaheartdisease,IHD)是当前世界范围内致死和致残的重要原因,中国心血管病死亡是城乡居民主要死亡原因之一。恢复血流灌注是治疗IHD最有效且最重要的方法,但恢复血流灌注造成的心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)是治疗缺血性心脏病过程中影响血运重建后患者即时生存率和远期心功能恢复的重要因素。目前临床上尚无治疗MIRI的首选特效药。既往研究发现,MIRI的发病机制有氧化应激失衡、钙超载、线粒体损伤、能量代谢障碍、自噬、凋亡、炎性反应等,且这些病理机制间相互交错,互为因果。其中,炎症反应贯穿缺血再灌注后心肌损伤和修复全过程,是决定最终心肌梗死大小和不良心肌重构的关键因素之一,是改善MIRI临床结局的关键治疗靶点。细胞焦亡是细胞死亡与炎症反应直接的、紧密的联系者,也是主要引起MIRI炎症反应的死亡方式之一,NLRP3炎症小体的形成和激活是介导MIRI细胞焦亡和炎症反应的关键步骤,因此,调控NLRP3的激活是调控心肌缺血再灌注损伤及炎症反应的关键策略。双参宁心胶囊(Shuangshen Ningxin,SSNX)是由人参总皂苷、丹参总酚酸和延胡索总生物碱组成的益气活血组分中药,具有益气活血、祛瘀止痛之功,主要用于治疗缺血性心脏病。前期研究发现SSNX对急性心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)和冠脉微循环障碍具有较好的保护作用,其机制主要包括抑制细胞自噬、改善线粒体功能、减少细胞凋亡等,但其抗炎作用研究较少,抗炎机制不清。因此,本研究拟建立大鼠急性MIRI模型,探索SSNX的抗炎作用和对NLRP3炎症小体及其介导的细胞焦亡的影响,并通过转录组和生信分析技术筛选和寻找SSNX调控NLRP3的通路和靶点,最后验证SSNX及其有效组分对调控NLRP3相关的通路和关键靶点的影响。阐明双参宁心胶囊保护MIRI的抗炎机理,完善双参宁心胶囊的药效机制。研究目的①明确双参宁心胶囊对NLRP3炎症小体及其介导的细胞焦亡和炎症反应的调控作用。②探索和验证双参宁心胶囊调控NLRP3炎症小体的通路和靶点,阐明双参宁心胶囊防治MIRI的作用机制。研究方法1.SSNX对急性MIRI大鼠的保护作用和抗炎作用研究建立大鼠急性MIRI模型,分为假手术组(Sham)、模型组(Model)、SSNX 90mg/kg组、SSNX45mg/kg组、尼可地尔组(NIC)和通心络组(TXL)。分析大鼠舌象,脉搏仪检测脉搏幅度,超声心动图检测大鼠心功能,声学造影检测大鼠心肌血流灌注达峰时间,HE染色观察心肌组织病理,依文思蓝染色、TTC染色、硫磺素染色后观察和计算心肌梗死面积和无复流面积,同时检测大鼠血浆凝血四项APTT、PT、TT、FIB,生化法检测大鼠血清心肌酶CK、CK-MB、LDH、AST和ALT含量,多因子检测大鼠血清IL-6、MCP-1、TNF-α等炎症因子含量,蛋白免疫印迹法检测心肌组织中NF-κB、TLR4、IL-1β、NLRP3蛋白的表达。2.SSNX对急性MIRI大鼠心肌NLRP3介导的细胞焦亡和炎症反应影响研究建立大鼠急性MIRI模型,分为Sham组,Model组,SSNX 90mg/kg组,MCC950组。ELISA法检测大鼠血清炎症因子IL-18、IL-1β含量,免疫组化法检测大鼠心肌GSDMD、NLRP3、Caspase-1蛋白表达,免疫荧光法检测大鼠心肌ASC、NLRP3双染和NLRP3、GSDMD双染蛋白表达,免疫印迹法检测大鼠心肌组织 ASC、NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β、IL-18蛋白表达。3.SSNX对NLRP3/caspase-1/GSDMD细胞焦亡通路调控作用研究构建NLRP3过表达的H9C2心肌细胞株(NLRP3-H9C2),建立H9C2和NLRP3-H9C2细胞缺氧缺糖/复氧复糖(OGD/R)损伤模型,分为正常对照组(NC),OGD/R损伤的H9C2心肌细胞组(OGD/R),SSNX干预OGD/R组(SSNX),OGD/R 损伤的 NLRP3-H9C2 心肌细胞组(NLRP3+),SSNX 干预 NLRP3+组(SSNX+NLRP3+),MCC950 干预 NLRP3+组(MCC950+NLRP3+);CCK-8法检测细胞活性,透射电镜观察细胞形态,多因子检测细胞上清炎性因子IL-18、IL-1β含量,免疫荧光法检测细胞ASC、NLRP3双染和NLRP3、GSDMD双染蛋白表达,蛋白质免疫印迹法检测大鼠心肌组织ASC、NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N 蛋白表达。4.探索SSNX调控NLRP3炎症小体的上游通路及靶点运用网络药理学技术预测SSNX保护MIRI的关键通路,筛选可能与调控NLRP3相关的通路;然后运用转录组测序技术探索SSNX保护急性MIRI大鼠心肌的关键基因,验证SSNX对网络药理学预测的通路与NLRP3所在通路的调节作用,预测和筛选Snatural biointerfaceSNX调控NLRP3的可能通路和靶点,验证关键靶点基因表达水平;最后运用分子对接技术预测SSNX调控该通路的潜在靶点。5.验证SSNX对NLRP3上游通路及靶点的调控作用上述研究预测到的SSNX调控NLRP3的可能上游通路是cAMP/PKA信号通路,PKA可能是关键靶点,因此主要建立OGD/R损伤的H9C2心肌细胞模型,加入PKA激动剂和抑制剂,探索PKA和NLRP3炎症小体的关系。实验分为正常对照组(NC),OGD/R损伤的H9C2心肌细胞组(OGD/R),SSNX干预OGD/R组(SSNX),PKA 激动剂 BucZ-VAD-FMK MWladesine 干预 OGD/R 组(BUC),PKA 抑制剂 H-89 dihydrochloride 干预 OGD/R 组(H-89),PKA 抑制剂 H-89 dihydrochloride 干预SSNX组;CCK-8检测细胞活性,ELISA法检测细胞中ATP、cAMP和cGMP含量,免疫荧光法检测PKA和NLRP3双染表达情况,蛋白质免疫印迹法检测cAMP/PKA/NLRP3 通路相关蛋白 PKA、P-PKA(Ser157)、PKG、P-PKG(Ser239)、NLRP3、P-NLRP3(Ser295)、Pro-caspase-1、Caspase-1、ASC 的表达。6.验证SSNX及其主要组分人参总皂苷(TG)对cAMP/PKA/NLRP3通路相关靶点的调控作用用分子对接技术预测到SSNX中可能主要调控cAMP/PKA/NLRP3通路的活性成分主要来源于人参总皂苷(TG),而cAMP/PKA通路与心肌能量代谢异常密切相关,因此建立大鼠急性MIRI模型检测SSNX和其组分TG对MIRI的保护作用和对cAMP/PKA/NLRP3通路相关靶点的影响。实验分为Sham组,Model组,SSNX 90mg/kg组(SSNX),人参总皂苷组(TG)。超声心动图检测心功能,HE染色检测大鼠心肌病理,依文思蓝染色和TTC染色观察大鼠心肌梗死面积,生化法检测大鼠心肌酶,透射电镜观察大鼠心肌组织超微结构,ELISA法检测大鼠血清cAMP、cGMP、ATP、ADP、AMP含量,质谱成像技术(MALDI-TOF/MS)检测大鼠心肌组织中能量代谢相关分子ATP、ADP、AMP、GTP、GDP、GMP和脂类代谢分子在心肌组织中的分布和含量,并检测SSNX中靶向到心肌的活性单体成分在心肌中的分布,免疫荧光法检测大鼠心肌中PKA和NLRP3双染、PKA和PKG双染的荧光表达,蛋白质免疫印迹法检测cAMP/PKA/NLRP3通路相关蛋白 PKA、P-PKA(Ser157)、PKG、P-PKG(Ser239)、NLRP3、P-NLRP3(Ser295)、Pro-caspase-1、Caspase-1、ASC 的表达。研究结果1.SSNX对急性心肌缺血再灌注损伤大鼠具有显著的保护作用。SSNX能改善MIRI大鼠舌像紫暗程度,增加脉搏幅度,升高大鼠心脏射血分数,缩短心肌血流灌注达峰时间,减轻心肌组织水肿,延长活化部分凝血活酶时间,降低血清心肌酶CK、CK-MB、LDH、AST和ALT含量,改善大鼠心肌组织超微结构,减少心肌梗死面积和无复流面积。2.SSNX可通过调节TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路发挥对急性MIRI的抗炎作用。SSNX能减少急性MIRI大鼠心肌促炎因子IL-6、TNF-α、MCP-1的含量,减少促炎蛋白TLR4、NF-κB、p-NF-κB、NLRP3、IL-1β的表达,减轻炎症反应,保护心肌。3.SSNX通过NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路调节NLRP3介导的细胞焦亡和炎症反应发挥对MIRI的保护作用。SSNX可以减轻MIRI损伤大鼠心肌组织水肿,降低细胞焦亡相关通路NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD-N 等蛋白表达水平,减少 IL-1 β、IL-18等炎症因子的释放,从而减轻炎症反应,保护心肌组织。同时,在H9C2心肌细胞中过表达NLRP3时,NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白表达升高,细胞焦亡相关蛋白GSDMD、GSDMD-N表达升高,透射电镜下心肌细胞超微结构呈焦亡形态,受损细胞增多,IL-18、IL-1β释放增加,细胞炎症反应加重;SSNX能降低OGD/R损伤的H9C2细胞和NLRP3-H9C2细胞中 NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD-N 等蛋白表达水平,减少IL-1β、IL-18等炎症因子的释放,减轻细胞形态和结构的损伤程度,保护心肌细胞,保护作用效果与NLRP3抑制剂MCC950相似。4.SSNX调控NLRP3炎症小体上游通路与cAMP/PKA相关,PKA是关键靶点。通过网络药理学预测发现SSNX调控NLRP3炎症小体的通路与cAMP相关通路有关;转录组测序结果验证了 SSNX能调控NLRP3所在通路和cAMP通路相关的众多基因,分析NLRP3所在通路和cAMP通路基因间的PPI互作关系发现cAMP相关通路中的Pkib、Pkia、Pkig基因在与NLRP3相关的通路PPI互作关系中是关键基因,而Pkib、Pkia、Pkig是编码PKA抑制剂相关蛋白的基因;PCR检测结果显示,SSNX升高了 MIRI大鼠心肌中PKA基因的表达,降低了NLRP3基因的表达,因此,SSNX对cAMP/PKA/NLRP3通路具有调控作用,PKA是SSNX调控该通路的关键分子。通过分子对接技术对接SSNX的入血成分和cAMP/PKA/NLRP3通路的关键靶点,发现 SSNX 中来源于人参皂苷的 ginsenoside Rd、ginsenoside Re、ginsenoside Rf、ginsenoside Rg2、ginsenoside Rh2、ginsenoside CK,来源于丹参总酚酸的Salvianolic acid B,来源于延胡索总生物碱的protopine等都与cAMP/PKA/NLRP3通路关键靶点有较好的结合能,结合能较好的药物单体中,来源于人参总皂苷(TG)的最多。5.SSNX和TG能通过cAMP/PKA通路调控NLRP3炎症小体的激活,PKA是关键靶点。PKA激动剂BUC和SSNX分别干预的OGD/R损伤的H9C2心肌细胞中,ATP、cAMP含量增加,cGMP含量减少,PKA荧光表达升高,NLRP3荧光表达降低,PKA 相关蛋白 PKA、P-PKA(Ser157)表达水平升高,P-NLRP3(Ser295)蛋白表达升高(Ser295可以抑制NLRP3炎症小体的组装与激活);PKA拮抗相关蛋白PKG、P-PKG(Ser239)表达降低,NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、Pro-caspase-1、Caspase-1、ASC蛋白表达降低,细胞活性增强;而PKA抑制剂H-89干预ODecitabine体内GD/R组则与BUC和SSNX的效果相反,H-89干预后SSNX活性减弱,ATP、cAMP含量降低,cGMP含量增加,PKA荧光表达降低,NLRP3荧光表达升高,PKA相关蛋白PKA、P-PKA(Ser157)表达水平降低,P-NLRP3(Ser295)蛋白表达降低;PKA拮抗相关蛋白PKG、P-PKG(Ser239)表达升高,NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、Pro-caspase-1、Caspase-1、ASC蛋白表达水平升高。同时,SSNX和TG可改善MIRI损伤的大鼠心肌中细胞能量代谢状态,增加大鼠心肌组织和血清中的ATP、cAMP含量,降低cGMP含量,同时增加PKA相关蛋白PKA、P-PKA(Ser157)表达水平,增高P-NLRP3(Ser295)蛋白表达;降低PKA拮抗相关蛋白PKG、P-PKG(Ser239)表达,降低NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、Pro-caspase-1、Caspase-1、ASC蛋白表达,减少炎症因子含量。6.SSNX可调节能量代谢物质和磷脂分子在心肌中的分布,激活cAMP/PKA通路。SSNX和其组分TG可以改善急性MIRI大鼠心肌组织中ATP、ADP、AMP、GTP、GDP、GMP 分布和血清中 cAMP、cGMP、ATP、ADP、AMP 含量。改变细胞内能荷状态,增加ATP的生成,同时改变心肌组织中PC、PA、PE、PG等脂质分子在心肌中的分布情况。7.SSNX中多种入血成分可以靶向到心肌组织质谱成像技术显示SSNX中有18种单体成分靶向到了心肌组织,其中9种来源于人参总皂苷,3种来源于丹参总酚酸,6种来源于延胡索总生物碱。分别是人参皂苷Rd、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rf1、人参皂苷Rg2、人参皂苷F2、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rh2、人参皂苷CK、丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、原阿片碱、延胡索乙素、脱氢紫堇碱、四氢药根碱、小檗碱、延胡索甲素。结论1.SSNX能改善急性MIRI大鼠心功能,增加冠脉血流,减轻心肌病理损伤,改善凝血功能,降低心肌酶水平,改善大鼠心肌超微结构,减少心肌梗死面积和无复流面积,从而保护心肌。2.SSNX可调节TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路,降低炎症因子含量和炎症相关蛋白表达,发挥对急性MIRI的抗炎作用。3.SSNX可调节NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路,减少炎症因子含量,降低炎症相关蛋白和焦亡相关蛋白表达,减轻炎症反应,减少细胞焦亡,从而发挥对急性MIRI和OGD/R损伤的H9C2心肌细胞的保护作用。4.SSNX可调控cAMP/PKA/NLRP3信号通路,增加ATP含量,激活cAMP信号传递,激活PKA,促使NLRP3的Ser295磷酸化,从而抑制NLRP3炎症小体的激活,降低炎症相关蛋白表达,减少炎症因子含量,从而发挥对急性MIRI大鼠心肌和OGD/R损伤的H9C2心肌细胞的抗炎作用。5.SSNX可调节能量代谢物质和磷脂分子在心肌的分布,改善心肌能量代谢状态及细胞膜结构和通透性,进而调节cAMP/PKA信号通路。6.SSNX中有18种入血成分可以靶向到心肌组织,这些成分可能对急性MIRI心肌具有重要的保护作用。综上所述,SSNX 可调节 TLR4/NF-κB/NLRP3 和 cAMP/PKA/NLRP3 通路调控NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡和炎症反应,从而发挥对急性心肌缺血再灌注损伤的保护作用。