胃癌(Gastric Cancer,GC)是消化道常见肿瘤,也是癌症相关性死亡的第三大原因。我国胃癌的发生率和死亡率在恶性肿瘤中均居第2位,5年总生存率低于30%,晚期胃癌病人易出现复发转移及化疗耐受。近年来随着手术联合放化疗、免疫制剂、生物靶向疗法的发展,胃癌患者的生存期和预后在一定程度上得到了延长与改善,但仍面临复发转移和化疗耐药的问题。肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)是指存在于肿瘤内部的具有自我更新、多向分化和致瘤性的一小部分细胞亚群,它决定了肿瘤发生、异质性等多种恶性生物学特性。肿瘤干细胞的特性能够激发肿瘤的形成、刺激肿瘤的复发转移并产生耐药性,大大影响肿瘤治疗的效果。由此可见,肿瘤干细胞的存在对肿瘤的形成与发展至关重要,针对肿瘤干细胞进行研究有望从源头上发掘肿瘤发生的机理,在治疗上实现里程碑式的突破。胃癌在中医理论中的认识属“反胃”、“胃脘痛”等病症范畴。胃癌发生的病因主要包括正虚、毒邪及痰凝血淤等。此外,气血郁结、脾胃失调、饮食不节与精神情致等也是常见的病因。胃癌病机总属邪实正虚,癌毒蕴胃。治疗总则为抗癌解毒,扶正补虚。治法围绕健运脾胃、固本培元;健脾理气,解毒散结,配合摄生调养和心理疏导。胃癌的诊疗应基于脏腑、阴阳、气血、寒热的动态平衡,并侧重扶正祛邪。对比单一使用西医或中医,中西医结合治疗胃癌的优点十分明显,其优势主要集中在改善患者的临床症状,加速术后恢复;增加放化疗的敏感性;减轻放化疗带来的毒副反应,提高机体免疫力,防止胃癌的复发与转移。因此,中医药联合手术、放化疗、生物治疗、免疫治疗等综合治疗手段,可以达到减毒增效、提高患者的生存率与生活质量的目的。南蛇藤(CelastrusOrbiculatus Thunb.),别名过山枫,是卫矛科南蛇藤属落叶藤状灌木,功效祛风止痛,活血消肿,解毒散瘀,主治跌扑损伤,痈疽脓肿,风湿性关节炎等,其茎、叶、根、藤均可入药。本课题组围绕南蛇藤茎提取物(Celastrus Orbiculatus Extract,COE)进行抗消化道肿瘤的药理学研究,发现其具有高效的抗肿瘤活性。课题组前期研究证实,南蛇藤茎提取物能够抑制胃癌细胞的上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)、减弱其侵袭迁移能力并增加胃癌的化疗敏感性。上皮间质转化是指上皮细胞通过切断细胞间接触、重塑细胞骨架而获得间质细胞表型的过程,它是介导肿瘤侵袭转移能力的关键步骤,也是令肿瘤细胞获得肿瘤干细胞恶性表型的重要途径之一。相关研究报道也显示,肿瘤干细胞同时也具备间质细胞特性,抑制EMT能够减弱肿瘤干细胞的干性表型特性。但是,南蛇藤提取物能否通过逆转胃癌细胞EMT破坏胃癌干样细胞表型,抑制胃癌的复发与侵袭尚不明确,国内外关于南蛇藤提取物抑制胃癌干样细胞的研究鲜有报道。本课题拟在前期实验的基础上,进一步深入研究南蛇藤提取物对胃癌干样细胞干性表型特性的影响。首先,课题组拟采用磁珠分选结合流式细胞术分离胃癌干样细胞,经无血清悬浮培养法构建胃癌干样细胞模型;接着通过高通量转录组学测序技术,筛选南蛇藤提取物干预胃癌干样细胞干性表型的靶点分子;最后在体内外通过分子生物学实验,结合临床组织芯片深入研究靶点分子在介导胃癌干样细胞特性中的作用与影响,从而阐明南蛇藤提取物对该靶点分子介导的胃癌干样细胞特性的作用与潜在机制,为开发治疗胃癌的新型药物提供实验依据,为治疗胃癌干样细胞提供新的策略,以解决胃癌的复发、转移和化疗耐药的临床困境。本课题分为如下四部分研究内容:第一部分:CD133+/CD166+人胃癌细胞亚群具有肿瘤干样细胞表型特性目的:本部分研究的目的是鉴定胃癌细胞中是否Bemcentinib分子式存在能被特定跨膜分子(CD133、CD166)标记,并具有肿瘤干细胞特性的胃癌细胞亚群,为治疗胃癌提供靶点和依据。方法:利用免疫磁珠分选法从人胃腺癌细胞系中分离CD133+/CD166+细胞亚群,并通过流式细胞术鉴定分选效率。对分选得到的细胞亚群的干性表型,包括成球能力、增殖能力、化疗耐受能力、克隆形成能力以及裸鼠体内成瘤能力进行评估。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)实验检测各细胞亚群肿瘤干细胞标记物(Nanog、Sox2、Oct-4和c-Myc)的表达水平。结果:与 CD133-/CD166-、CD133-/CD166+、CD133+/CD166-细胞群和亲代细胞相比,CD133+/CD166+细胞亚群的成球能力、增殖能力、化疗耐受能力、克隆形成能力以及体内成瘤能力最强。在CD133+/CD166+细胞中,肿瘤干细胞标记物Oct-4和c-Myc在mRNA和蛋白质表达水平均高于亲代细胞和其他细胞亚群。结论:CD133+/CD166+胃癌细胞亚群具有肿瘤干样细胞特性,可作为胃癌干样细胞模型。第二部分:PTBP1促进胃癌细胞增殖并维持干性表型目的:为了阐明PTBP1在维持胃癌细胞干性表型中的作用,并深入挖掘其潜在机制。方法:通过临床组织芯片验证PTBP1的蛋白表达与胃癌患者的预后及生存期之间的联系。利用western blot实验研究胃癌细胞系与胃上皮细胞中PTBP1的表达与胃癌的关联。利用qRT-PCR和western blot实验比较贴壁培养的胃癌细胞与悬浮培养的胃癌干样细胞模型中肿瘤干细胞标志物的表达差异情况。利用小干扰RNA,质粒和慢病毒载体分别构建PTBP1敲减和过表达的瞬时及稳定表达的细胞株,通过细胞计数(Cell Counting Kit-8,CCK-8)实验、平板克隆形成实验、EdU实验检测PTBP1敲减和过表达对细胞增殖能力的影响;通过western blot实验检测PTBP1的敲减和过表达对细胞周期蛋白的影响;通过成球实验、ALDselleckchemH1活性检测实验、侧群细胞比例检测实验及高内涵细胞成像仪检测PTBP1的敲减和过表达对胃癌细胞干性表型的影响。在裸鼠移植瘤模型中,构建PTBP1敲减和过表达体内模型,利用小动物活体成像分析PTBP1对体内致瘤能力的影响。结果:与癌旁组织相比,PTBP1在胃癌组织中呈高表达(P<0.001),且高表达PTBP1与胃癌患者总生存期呈负相关(P=0.002),这与TCGA数据库中对PTBP1的分析结果一致。与胃上皮细胞相比,胃癌细胞系MKN28、MKN45、AGS和HGC-27中PTBP1均呈高表达,提示PTBP1的表达与胃癌的发生密切相关。悬浮培养的胃癌干样细胞模型中PTBP1和肿瘤标志物的表达均高于贴壁培养的胃癌细胞,提示PTBP1的表达与肿瘤细胞的干性表型相关。CCK-8和平板克隆实验结果显示PTBP1的敲减能够限制胃癌细胞的增殖,而PTBP1的过表达则会促进胃癌细胞增殖。EdU实验结果显示,PTBP1的敲减能够诱导细胞周期阻滞在G1期,并且减少S期的细胞比例,从而抑制细胞增殖。而过表达PTBP1则会使细胞积累在G2期,促进细胞增殖分裂。蛋白免疫印迹实验结果表明,敲减PTBP1能够抑制细胞周期相关蛋白Cyclin D1的表达,促进p21和p27的表达,而过表达PTBP1则呈现相反的作用,提示PTBP1能够通过调控细胞周期影响胃癌细胞的增殖。成球实验、ALDH1活性检测实验和侧群细胞比例测试实验结果说明,敲减PTBP1能够抑制细胞成球能力、降低ALDH1活性、下调耐药细胞的比例,过表达PTBP1的结果则相反。高内涵细胞成像系统分析结果表明,PTBP1敲减细胞的迁移能力减弱,而过表达PTBP1则可促进细胞的迁移能力。敲减PTBP1能够下调肿瘤干细胞标志物(c-Myc、Oct-4、Sox2、Nanog)的表达,而过表达PTBP1则能上调肿瘤干细胞标志物的表达。裸鼠移植瘤体内实验结果表明,在荷瘤裸鼠体重基本相当的前提下,PTBP1敲减组的移植瘤增殖受到抑制,而PTBP1过表达组肿瘤增殖的速度明显加快。结论:PTBP1能够通过维持胃癌细胞干性表型促进胃癌的增殖。第三部分:PTBP1通过泛素蛋白酶途径介导c-Myc的稳定性维持胃癌干性表型目的:探讨PTBP1对维持胃癌干性表型功能的潜在机制。方法:通过免疫荧光实验检测PTBP1与c-Myc的细胞共定位情况,分析两者的表达联系。通过qRT-PCR和western blot实验检测PTBP1对c-Myc表达的调控作用。在添加蛋白质合成抑制剂CHX后,按设定时间提取细胞蛋白,测定PTBP1对c-Myc降解速率的影响。在PTBP1存在与缺失的情况下,分别添加蛋白酶抑制剂MG132,自噬液泡ATP酶抑制剂Bafilomycin A1和溶酶体抑制剂Leupeptin,挖掘PTBP1对c-Myc的降解作用的主要通路。通过免疫共沉淀实验,分析PTBP1对c-Myc泛素化水平的调控作用。通过western blot分析PTBP1对c-Myc泛素化降解的两个关键的磷酸化位点(Ser62,Thr58)、E3泛素连接酶FBW7和去泛素化蛋白USP28表达的调控作用。在PTBP1正常表达与过表达细胞株中,添加针对c-Myc合成的特异性抑制剂10058-F4,分析c-Myc的缺失对PTBP1的表达影响,确定PTBP1与c-Myc的上下游关系。在PTBP1敲减细胞株中过表达c-Myc,并结合体内外实验,观察c-Myc的过表达能否挽救PTBP1缺失对肿瘤干细胞表型的影响。结果:免疫荧光实验结果提示PTBP1(红色)与c-Myc(绿色)共同定位于细胞核,免疫共沉淀结果也发现PTBP1与c-Myc蛋白存在结合,PTBP1的表达在蛋白水平上与c-Myc呈正相关。而在mRNA水平,PTBP1的敲减或过表达无法引起c-Myc的变化,提示PTBP1对c-Myc的调控是在转录后水平。添加蛋白酶抑制剂CHX后,PTBP1的缺乏会加速c-Myc蛋白的降解,而PTBP1的过表达则会维持c-Myc蛋白的稳定性。通过比较三种蛋白降解途径的抑制剂的挽救效果,确证MG132能够阻断由PTBP1缺失造成的c-Myc蛋白降解的效果。免疫共沉淀实验证实PTBP1调控c-Myc蛋白降解是通过泛素-蛋白酶体途径,敲减PTBP1能够促进c-Myc的泛素化降解,而过表达PTBP1则会抑制c-Myc的泛素化降解,且以上结果都会被添加MG132所挽救。添加c-Myc蛋白的特异性拮抗剂label-free bioassay10058-F4后,与对照组相比,PTBP1过表达组中PTBP1的蛋白表达不会受到10058-F4的影响,提示c-Myc是PTBP1的下游分子。在PTBP1敲减细胞株中构建过表达c-Myc,结合体内外实验证实,过表达c-Myc能够挽救由PTBP1敲减造成的胃癌干细胞样表型缺失的影响。结论:PTBP1通过介导c-Myc的稳定性维持胃癌干性表型。第四部分:南蛇藤提取物通过TGF-β/Smad信号通路抑制胃癌干样细胞的干性表型目的:探讨南蛇藤提取物对胃癌干样细胞干性表型的影响,探索其可能的作用及机制。方法:利用无血清悬浮培养构建胃癌干样细胞模型;通过免疫荧光实验、western blot实验和流式细胞术检测胃癌干样细胞中CD133和CD166的表达情况。设置不同浓度的南蛇藤提取物剂量组对胃癌干样细胞进行干预,通过CCK-8实验、成球实验、western blot实验和流式细胞术检测南蛇藤提取物对肿瘤干细胞标志物、增殖和凋亡等干样细胞表型的影响。利用小干扰RNA敲减胃癌干样细胞中PTBP1的表达,通过western blot和高内涵细胞成像分析系统,检测敲减PTBP1后对TGF-β信号通路的影响。通过设置对照组、TGF-β组、COE组和TGF-β+COE组,利用western blot实验检测南蛇藤提取物对TGF-β信号通路的影响以及PTBP1在其中发挥的作用,从而明确PTBP1是否参与南蛇藤提取物通过TGF-β/smad信号通路抑制胃癌干样细胞特性。结果:与贴壁培养的胃癌细胞相比,无血清培养的胃癌干样细胞中CD133和CD166及Oct-4、Sox2、ALDH1和Nanog等肿瘤标志物的表达均明显高表达(P<0.05);南蛇藤提取物呈剂量依赖性的下调胃癌干样细胞中肿瘤干性生物标记物的表达(P<0.05),且以浓度依赖性方式抑制胃癌干样细胞的增殖并诱导其凋亡,这提示南蛇藤提取物能够抑制胃癌干样细胞的干性特征。敲减胃癌干样细胞中PTBP1的表达能够下调干性标志物及TGF-β/smad信号通路相关蛋白的表达(P<0.05);同时,对比TGF-β和南蛇藤提取物单药和联合用药的结果得出,单用TGF-β能够刺激Smad信号通路的激活,并上调肿瘤干细胞标记物的表达,单用南蛇藤提取物组则效果相反,而联合用药则显示南蛇藤提取物能够部分消除TGF-β的作用,提示南蛇藤提取物能够通过TGF-β/Smad信号通路抑制胃癌干样细胞的干性表型。结论:南蛇藤提取物能够降低胃癌干样细胞的干性表型特性,其机制可能与南蛇藤提取物抑制TGF-β/Smad信号通路的激活有关。