单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)简称单增李斯特菌,是重要的革兰氏阳性食源性致病菌。LM能够在低温和高盐浓度等条件下存活,可以穿过胃肠屏障、胎盘屏障和血脑屏障。内化素(Internalin,Inl)是单增李斯特菌促进其侵入宿主细胞的表面蛋白,在细菌入侵宿主细胞过程中发挥黏附与侵袭作用,目前发现25种内化素,内化素G研究较少。本研究旨在建立一种双抗夹心ELISA方法,便于检测环境中的李斯特菌,为李斯特菌病的快速诊断提供技术支撑。基于此,本论文完成了以下研究工作:1.单增李斯特菌内化素G缺失株的转录组测序单增李斯特菌内化素G是由Lmo0262基因编码的细胞表面蛋白,含有LPXTG(Leu-Pro-X-Thr-Gly,其中X是任何氨基酸)结构的内化素。为探究内化素G的功能,使用在线分析软件对内化素G蛋白的二级结构、三级结构和互作蛋白进行预测,Lmo2026、Lmo0514、Lmo0327、内化素H、内化素I等为内化素G潜在的互作蛋白。并对单增李斯特菌标准株和内化素G缺失株进行转录组测序(RNA-Sequencing,RNA-Seq),对差异表达基因进行分析,发现表达上调基因中Lmo0205(Plc B)、Lmo0202(Hly)、Lmo1176(Eut C)、Lmo1786(Inl C)、Lmo0204(Act A)和LAhR-mediated toxicitymo1175(Eut B)都是LM的主要毒力因子,协同参与了细菌的黏附与侵袭,提示缺失内化素G后LM的毒力可能增强。挑选部分差异表达基因进行q RT-PCR验证,基因表达上下调趋势与RNA-Seq结果一致;黏附和侵袭试验验证了InlG缺失后LM对细胞的内化作用增强。2.内化素G蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性分析以纯化的InlG蛋白为抗原免疫6～8周龄BALB/c小鼠,采用细胞融合和杂交瘤筛选技术建立InlG单克隆抗体的杂交瘤细胞系。经过两次亚克隆筛选,获得3株InlG蛋白单克隆抗体,分别命名为1D2、1D2-1和2H10,并鉴定单克隆抗体的亚型及其基本生物学特性。结果表明三株抗体均为Ig G_1亚型抗体。Western-blot结果表明,InlG单抗能特异性识别LM的内化素G蛋白,与沙门氏菌、大肠杆菌、枯草杆菌、白色葡萄球菌和柠檬色葡萄球菌均无交叉反应,但与李斯Regorafenib molecular weight特菌其他成员可发生明显交叉反应。3.李斯特菌双抗夹心ELISA检测方法的初步建立本研究以内化素G单抗为捕获抗体、单增李斯特菌兔多抗(本实验室存)为检测抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔ICompound C临床试验g G(Ig G-HRP)为标记抗体,建立双抗体夹心ELISA检测方法,该方法能够有效检测李斯特菌。通过优化,确定检测方法的最佳条件。用此方法检测5株不同的李斯特菌、5株非李斯特菌,结果表明该方法能特异性检测李斯特菌。选择生牛乳和生牛肉接种不同浓度的LM,当二者的接种量为1.0×10~2CFU/m L时,培养21 h后可检出LM。本研究建立的方法便于更加快捷地从食品中检测李斯特菌的污染情况。