随着经济水平的提高和人们生活方式的转变,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的患病率在全球显著上升。流行病学调查显示,我国NALFD的患病率高达29.8%,且2型糖尿病和肥胖患者NAFLD的患病率进一步升高,具有更高的肝纤维化风险。NAFLD虽然进展缓慢,但若进展到肝纤维化,全因死亡率明显升高,严重威胁人类健康。目前尚不完全清楚NAFLD的具体发病机制,且治疗方法有限。因此,探究NAFLD的发病机制及治疗靶点具有重要的临床意义。铁死亡是一种新型的程序性细胞死亡方式,其特征为细胞内铁超载引发的氧化应激和细胞脂质过氧化。研究发现,铁死亡可导致单纯肝细胞脂肪变性向肝纤维化进展。NAFLD患者存在铁代谢异常和肝脏铁聚积,铁螯合剂能够改善NAFLD患者的肝脏病理,因此,抑制铁死亡可能成为治疗NAFLD的一种新策略。利拉鲁肽是一种胰高糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂,能刺激胰岛β细胞的增殖和分化,抑制胰高血糖素的分泌,还能起到抑制食欲和延缓胃排空的作用。近年研究显示,利拉鲁肽除了上述作用外,还具有抗氧化应激、改善血管内皮功能、减少肝内脂肪累积等作用。最新研究显示,利拉鲁肽可以抑制糖尿病小鼠肝脏铁死亡,减轻肝脏的氧化应激损伤。本研究通过给予肥胖2型糖尿病合并NAFLD患者利拉鲁肽治疗,观察利拉鲁肽对研究对象的体重、人体成分指标、糖脂代谢、铁代谢、氧化应激以及肝脏脂肪含量等方面的影响。此外,通过棕榈酸/油酸诱导HepG2细胞,探讨铁死亡是否参与NAFLD的发病,利拉鲁肽可否通过抑制铁死亡发挥有益作用。第一部分利拉鲁肽对肥胖2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病患者肝脏脂肪含量的影响目的:观察肥胖2型糖尿病合并NAFLD患者应用利拉鲁肽治疗后人体成分、糖脂代谢、铁代谢、氧化应激Alisertib水平和肝脏脂肪含量的变化。方法:纳入45例肥胖2型糖尿病合并NAFLD患者,在常规生活方式(饮食运动管理)的干预下Imidazole ketone erastin,给予利拉鲁肽治疗,共干预24周。治疗前后测量研究对象的身高、体重、腰围、血压,计算体质量指数(BMI);检测研究对象的生化指标:空腹血糖、血脂、糖化血红蛋白(Hb A1c)、转氨酶、血清白蛋白;检测铁代谢相关指标:血清铁、铁调素、血清铁蛋白;检测氧化应激相关指标:超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA);测量研究对象的身体成分、肝脏脂肪衰减值(CAP)。比较治疗前后上述指标的变化,分析CChemical and biological propertiesAP差值与各临床指标差值的相关性,分析CAP变化的影响因素。同期观察利拉鲁肽治疗的安全性。结果:1.通过24周利拉鲁肽的治疗,研究对象的体重、体重指数、腰围、骨骼肌含量、体脂肪含量、体脂率和内脏脂肪面积显著下降(P<0.05)。2.通过24周利拉鲁肽的治疗,研究对象的空腹血糖、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、糖化血红蛋白、胰岛素抵抗指数、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、铁蛋白、铁调素水平均显著下降(P<0.05);高密度脂蛋白胆固醇明显升高(P<0.05)。收缩压、舒张压、总胆固醇、血清白蛋白水平较治疗前下降,但是差异无统计学意义(P>0.05),血清铁水平较治疗前升高,但是差异无统计学意义(P>0.05)。3.和治疗前的基线值相比,利拉鲁肽治疗24周后,研究对象的SOD活性显著升高,MDA水平显著下降(P<0.05)。4.利拉鲁肽治疗24周后,研究对象肝脏的CAP较治疗前显著下降(P<0.05)。5.相关性分析显示,CAP的变化值与体重、体重指数、腰围、内脏脂肪面积、铁蛋白、铁调素、MDA的下降差值呈正相关(r=0.630、0.661、0.355、0.360、0.324、0.638、0.496,P<0.05);与高密度脂蛋白胆固醇、SOD活性上升的差值呈负相关(r=-0.372、-0.495,P<0.05)。多元线性回归分析显示,体重指数、铁蛋白、铁调素、MDA的差值是CAP下降的独立影响因素(P<0.05)。6.利拉鲁肽治疗后,出现不能耐受的腹泻、恶心、纳差不良反应者3人(6.7%),停用利拉鲁肽治疗后上述症状逐渐缓解。研究过程中,利拉鲁肽治疗出现恶心、纳差者8人(17.8%),便秘者2人(4.4%),无力者2人(4.4%),头痛者1人(2.2%),心悸者1人(2.2%),随着饮食结构的调整和治疗时间的延长,上述症状均可得到缓解。治疗期间均未发生低血糖和严重不良事件。小结:1.利拉鲁肽治疗24周可以显著降低肥胖2型糖尿病合并NAFLD患者的体重、腰围、体脂肪含量以及内脏脂肪面积,改善身体成分,未发生营养不良情况。2.利拉鲁肽治疗24周可以显著改善肥胖2型糖尿病合并NAFLD患者的血糖血脂代谢紊乱,减轻胰岛素抵抗;可以显著降低丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶水平,改善肝功能。3.利拉鲁肽治疗24周可以显著降低肥胖2型糖尿病合并NAFLD患者的肝脏脂肪含量,减少肝脏铁聚积,提高机体抗氧化应激能力,减少脂质过氧化。4.利拉鲁肽治疗24周后,肥胖2型糖尿病合并NAFLD患者肝脏脂肪含量的下降与体重指数的下降、铁代谢的改善、脂质过氧化水平下降密切相关,利拉鲁肽可能通过抑制铁死亡改善NAFLD患者肝内脂质聚积。5.利拉鲁肽单独应用于肥胖2型糖尿病合并NAFLD患者耐受性好,低血糖发生率低,安全性高。第二部分利拉鲁肽抑制棕榈酸/油酸诱导的HepG2细胞铁死亡,降低细胞内脂质含量目的:通过棕榈酸/油酸诱导HepG2细胞,明确铁死亡是否参与NAFLD的发病以及利拉鲁肽对NAFLD的干预机制。方法:将HepG2细胞分为对照组(Con组):含有10%FBS的MEM培养基孵育细胞24h;游离脂肪酸组(FFA组):终浓度为200μM/100μM的棕榈酸/油酸培养基孵育24h;利拉鲁肽干预组(FFA+LI组):终浓度为100n M的利拉鲁肽并含200μM/100μM的棕榈酸/油酸培养基,孵育细胞24h。分别检测各组细胞内甘油三酯含量,应用油红O染色方法观察细胞中脂质沉积情况;检测各组细胞内谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)的活性和铁含量。应用real-time PCR和蛋白质免疫印记电泳方法检测各组细胞催化亚基溶质载体家族7成员11(SLC7-A11)、转录因子E2相关因子2(Nrf2)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、转铁蛋白受体1(TFR1)基因和蛋白的表达。结果:1.与Con组比较,FFA组HepG2细胞内橘红色脂滴和甘油三酯含量显著增加;经利拉鲁肽干预后,FFA+LI组HepG2细胞内橘红色脂滴和甘油三酯含量显著减少,但仍高于Con组(P<0.05)。2.与Con组比较,FFA组HepG2细胞内SOD活性、GSH水平显著降低;利拉鲁肽干预后,FFA+LI组细胞内SOD活性、GSH水平明显升高,但仍低于Con组(P<0.05)。3.与Con组比较,FFA组HepG2细胞内MDA水平、铁含量显著升高;经利拉鲁肽干预后,FFA+LI组细胞内MDA水平、铁含量显著低于FFA组,但仍高于Con组(P<0.05)。4.与Con组比较,FFA组HepG2细胞SLC7A11蛋白表达显著降低(P<0.05);经利拉鲁肽干预后,FFA+LI组SLC7A11蛋白表达有所升高,但与FFA组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与Con组比较,FFA组HepG2细胞Nrf2、GPX4蛋白表达显著降低;经利拉鲁肽干预后,FFA+LI组HepG2细胞Nrf2、GPX4蛋白表达明显高于FFA组,但仍低于Con组(P<0.05)。与Con组相比,FFA组HepG2细胞TFR1蛋白表达显著升高;经利拉鲁肽干预后,与FFA组相比,FFA+LI组HepG2细胞TFR1蛋白表达显著降低,但仍高于Con组(P<0.05)。5.与Con组相比,FFA组HepG2细胞SLC7A11 m RNA表达显著降低(P<0.05);经利拉鲁肽干预后,FFA+LI组SLC7A11 m RNA表达有所升高,但与FFA组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与Con组比较,FFA组HepG2细胞Nrf2、GPX4 m RNA表达显著降低;经利拉鲁肽干预后,FFA+LI组HepG2细胞Nrf2、GPX4 m RNA表达明显高于FFA组,但仍低于Con组(P<0.05)。与Con组比较,FFA组HepG2细胞TFR1 m RNA表达显著升高;经利拉鲁肽干预后,与FFA组相比,FFA+LI组HepG2细胞TFR1 m RNA表达显著降低,但仍高于Con组(P<0.05)。小结:1.棕榈酸/油酸诱导的HepG2细胞脂质含量增加,利拉鲁肽可减少肝细胞内脂质沉积。2.棕榈酸/油酸诱导的HepG2细胞出现抗氧化应激能力降低、铁超载以及细胞脂质过氧化增加等铁死亡的特征;与铁死亡相关的蛋白SLC7A11、Nrf2、GPX4表达降低,TFR1表达增加,提示铁死亡参与了NAFLD的发病。3.利拉鲁肽通过上调铁死亡相关蛋白Nrf2、GPX4的表达,下调TFR1的表达,提高棕榈酸/油酸诱导的HepG2细胞的抗氧化应激能力、减轻细胞内铁超载、减少细胞脂质过氧化,抑制铁死亡。结论:1.利拉鲁肽可能通过抑制铁死亡改善肥胖2型糖尿病合并NAFLD患者肝内脂质聚积。2.棕榈酸/油酸诱导的HepG2细胞出现抗氧化应激能力降低、铁超载以及细胞脂质过氧化增加等铁死亡的特征。3.利拉鲁肽通过上调铁死亡相关蛋白Nrf2、GPX4的表达,下调TFR1的表达,抑制铁死亡,减少棕榈酸/油酸诱导的HepG2细胞脂质沉积。