免疫系统包括免疫防御、监视和免疫调节,能够保障人体的健康的同时也与Naporafenib细胞培养各种疾病的病因有关。目前,有许多药物可用以调节人类的免疫功能,如左旋咪唑、环磷酰胺和大环内酯类等,但大部分合成免疫调节药物会对机体产生毒副作用。因此,合成免疫调节药物不利于预防或长期使用。在这方面,由于源自天然食品的免疫活性剂对人体健康的有效性和安全性,因此,具有潜在的开发价值和意义。近年来,海洋生物中生物活性化合物的研究已成为一个热门话题。最近的注意力集中在提供具有不同生理功能的生物活性肽,如二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制肽、抗氧化肽、血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽和免疫活性肽等。凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是全球虾养殖业的主要物种之一。在加工过程中,40-50%的副产物(头,壳和尾巴)很少得到应用。其中,虾头中富含有优质蛋白质和必需氨hepatocyte size基酸,可作用提取生物活性肽的潜在来源。然而,从凡纳滨对虾中提取免疫活性肽的研究尚未报道,特别是利用其废弃的头部。本文采用不同种类的酶从凡纳滨对虾虾头中制备了免疫活性酶解物,进一步通过分离纯化、鉴定得到免疫活性肽。利用体外细胞实验和体内动物实验评估其活性肽的免疫活性作用,并对免疫活性肽的稳定性及作用机制进行探究。此研究为开发凡纳滨对虾虾头免疫活性肽的功能性食品提供理论基础,从而实现低值虾类副产物的利用。1.以巨噬细胞RAW264.7相对增殖率和水解度为评价指标,筛选了最适酶解凡纳滨对虾虾头制备免疫活性肽的蛋白酶,考察了影响酶解效果的因素,并使用响应面优化得出酶解工艺。实验结果表明制备凡纳滨对虾虾头部免疫活性肽的最适蛋白酶为动物蛋白酶,最佳酶解制备虾头免疫活性肽工艺为:酶解时间为5 h,加酶量为3500 U/g蛋白,液料比为6.1:1(m L/g)。在该条件下通过重复验证实验,测得巨噬细胞相对增殖率为160.78%。2.凡纳滨对虾虾头酶解液通过超滤膜(10 k Da、3 k Da、1 k Da)得到四种不同分子量组分,检测其对巨噬细胞增殖率的影响。结果表明,M4组分(<1 k Da)具有最高的细胞增殖率(162.15±5.27%),并在50-150μg/m L内可以明显促进巨噬细胞产生NO,提高其吞噬率及TNF-α、IL-2、IL-6、IL-1β的分泌量。将M4组分通过Sephadex G-15得到五个组分(M4-1、M4-2、M4-3、M4-5和M4-5),其中M4-1具有最高的细胞增殖率(162.26±10.62%),并在相关免疫指标(吞噬能力、NO、TNF-α、IL-1β,IL-2、IL-6的分泌量)呈剂量发挥免疫调节作用。故利用LC-MS/MS对最优M4-1组分鉴定肽序列,结果得到195条肽序列,结合计算机模拟评分候选出六条免疫活性肽:PSPFPYFT、SAGFPEGF、GPQGPPGH、QGF、PGMR、WQR。3.对固相合成的六条免疫活性肽做免疫效果评价的验证,并评估其稳定性(胃肠道消化、热处理、p H处理),得出PSPFPYFT、GPQGPPGH、PGMR和WQR均表现出较好的免疫活性和稳定性。运用分子对接将多肽配体与蛋白受体TLR2、TLR4/MD-2对接模拟评分,并选择亲和能值较低的两个体系(WQR-TLR4/MD-2和GPQGPPGH-TLR2)运用分子动力学模拟技术进一步分析其作用机理。结果表明肽与TLR受体上的结合位点形成氢键相互作用,形成强结合作用,使多肽表现出更好的免疫活性。MM/GBSA分析也得到了这两种配合物的结合自由能,指示其稳定的结合。4.通过蛋白含量、氨基酸组分以及稳定性评价,结果得出<1 k Da组分的虾头肽相比凡纳滨对虾酶解液,在经超滤去除杂质的同时,还能具有更好的稳定性,更适合作为体内实验的原料。因此,选用<1 k Da组分浸泡免疫低下的斑马鱼,进行体内免疫指标的测定,结果表Cell Cycle抑制剂明凡纳滨虾头肽具有增强巨噬细胞吞噬功能与T细胞荧光强度功效,能够上调IL-1β、TNF-α和IFN-γ基因表达,增强机体的体内免疫水平。