水稻是重要的粮食作物,叶片衰老的调控对于水稻的产量和品质具有重要的意义。褪黑素(N-乙酰5-甲氧基色胺)是一种重要的植物激素,广泛参与植物的生长、发育阶段转换、逆境响应等生命过程的调节。与此同时,褪黑素也是植物衰老过程中的重要调控因子,研究表明通过施加外源褪黑素可以有效地延缓植物的衰老进程。然而,内源褪黑素调控水稻叶片衰老的分子机制目前尚不明确。为了阐明内源褪黑素调控水稻叶片衰老的潜在机理,本研究构建了褪黑素合成途径关键基因OsCOMT的转基因材料,通过表型考察和生理指标测定揭示了OsCOMT通过合成褪黑素延缓叶片衰老的功能,进一步通过转录组和表观组学测序,揭示了内源褪黑素延缓叶片衰老的分子机制与表观机理。主要研究结果如下:1.通过对黑暗诱导条件下OsCOMT转基因植株表型考察,发现OsCOMT-OE株系相比于野生型(WT)褪黑素水平升高,衰老延缓,叶绿素含量增加;而OsCOMT-Cas9突变体相较于WT褪黑素水平下降,出现早衰表型,且叶绿素含量下降。外源施加褪黑素能够显著回复OsCOMT-Cas9突变体的早衰表型,其褪黑素水平和叶绿素含量均恢复到WT水平。结果表明内源褪黑素含量降低是OsCOMT-Cas9突变体提前衰老的原因。2.通过检测氧化还原水平和生理指标,发现OsCOMT-Cas9突变体相比于WT积累了更多的过氧化氢(H2O2),细胞活性显著降低,且过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性显著降低。表明内源褪黑素BMS-907351水平的降低负调控细胞抗氧化活性,进而导致早衰表型。3.为了明确内源褪黑素调控水稻叶片衰老的分子机制,对OsCOMT-Cas9突变体和WT水稻幼苗进行转录组测序,差异基因(DEGs)富集分析结果显示OsCOMT-Cas9突变体相较于WT表达上调的差异基因主要富集在转录调控、RNA合成、胁迫响应途径、信号转导以及茉莉酸信号途径上;而表达下调的差异基因主要富集在光合作用相关途径、蛋白质的生物合成途径、氧化还原过程、脂质和有机酸代谢中。同时,在外源褪黑素处理后OsCOMT-Cas9突变体的基因表达水平得到了一定的恢复。结果表明在暗诱导叶片衰老过程中,褪黑素含量的降低导致了转录组的显著变化,且褪黑素在叶片衰老的转录重编程中起着重要作用。4.为了明确黑暗诱导叶片衰老过程中内源褪黑素对全基因组DNA甲基化水平的影响,对暗诱导下的WT以及OsCOMT-Cas9突变体进行了全基因组甲基化测序。结果显示在暗诱导衰老过程中,OsCOMT-Cas9突变体的CG和CHG甲基化水平相比于WT显著下降,同时CHH甲基化水平发生变化。其中,CG甲基化变化主要发生在基因区域,CHG甲基化变化主要发生在转座子区域,而CHH甲基化变化大量分布于基因启动子区。5.综合分析DNA甲基化变化和基因表达水平变化,发现基因区域CG甲基化的丢失与部分光合作用和碳水化合物代谢相关基因的表达下降相关,而转座子区域的CG和CHG甲基化丢失与转座子相关基因的表达激活相关。结果表明褪黑素通过维持CG和CHG甲基化水平,促进光合作用相关基因表达,抑制转座子相关基因的表达,维护基因组的稳态,从而延缓叶片衰老。此外,CHH差异甲基化与部分衰老selleck产品相关基因(Senescence Associated Genes,SAGs)和转座子相关基因(TEGs)的表达变化相关,表明褪黑素可能通过调控这些区域的CHH甲基化调控SAGs的表达动态变化,从而影响叶片衰老过程。6.通过测定S-腺苷甲硫氨酸(SAM)含量,发现其水平在OsCOMT-Cas9突变体中显著低于WT,且其代谢途径相关基因表达水平在OsCOMT-Cas9突变体中的表达量相比于WT显著下降,而外源褪黑素处理能够显著回复这些基因的表达水平。通过外源SAM处理OsCOMT-Cas9突变体,其早衰表型和SAGs表达水平均获得了明显回复。结果表明褪黑素可能通过调节SAM的生物合成和代谢来影响DNA甲基化和基因表达水平。7.通过测定各株系不同时期的单株籽粒产量以及Groundwater remediation叶片光合作用指标,发现OsCOMT可以通过延缓叶片衰老和提高光合效率促进水稻籽粒产量提升,表明OsCOMT通过合成褪黑素调控叶片衰老的机制在水稻育种中具有重要的应用价值。综上,本研究发现OsCOMT-Cas9突变体由于内源褪黑素含量降低,在黑暗诱导条件下相较于WT提前衰老。转录组和DNA甲基化分析表明,褪黑素缺乏通过影响DNA甲基化稳态来调节光合作用和代谢相关基因的表达水平以及基因组稳定性。本研究从表观遗传学的新视角揭示了植物内源褪黑素的调控机制,并为水稻的遗传改良提供了新的参考依据。