产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringene)是由Wlechii和Nuttad(1892)分离于人腐败尸体血管中的一种条件致病菌,该菌为芽孢杆菌科,梭状芽孢杆菌属,其菌落呈半透明并具有光滑凸起、边缘整齐等特点,多半呈粗杆状形式存在,在一般条件下即可生长,其最适生长温度为37～47℃、可分解葡萄糖、麦芽糖等产生大量的二氧化碳和氢气,但不易形成芽孢,当处于无糖环境中、适合的温度及p H值、碳源等比例充足的情况下则有利于形成芽孢,并且芽孢在114℃的高温下能存活1～4h,属条件较温和的专性厌氧菌,也是典型的毒素致病菌。其广泛存在于大自然与人类生活环境中,主要作用于人体消化系统,常见于人畜肠道、食物、土壤、以及粪便中等,因此该菌能够引起人类气性坏疽等疾病,是重要的病原微生物。其重要的外毒素有α、β、ε、ι、γ、δ、θ、η、κ、λ、μ、υ等12种,其中前四种起主要致病作用,可引起多种动物的腹泻、坏死性肠炎和肠毒血症,以及人类食物中毒和痢疾等疾病。因此根据前四种α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)和ι(CPI)致死性毒素的抗毒素中和试验,将其分划为A、B、C、D、E五种类型,这五种类型中,以A型产气荚膜梭菌产生的α毒素为引起多种疾病的关键致病因素。本课题组先期已经利用噬菌体抗体库技术,从全人源单链抗体库Tomlinson I+J中获取了针对A型产气荚膜梭菌α毒素的全人源Sc Fv抗体基因8B,并构建了Sc Fv-8B基因原核表达载体,获得了Sc Fv-8B大肠杆菌表达载菌,为了增加单链抗体的稳定性,本研究将单链抗体进行改构,将Sc Fv-8B与人源抗体恒定区不同结构域相连,构建单分子抗体,筛选免疫结合活autophagosome biogenesis性最优的单分子抗体并获得工程菌,对工程菌进行发酵培养,摸索纯化工艺,获得单分子抗体纯品,并进行体外实验以验证抗体的亲和力、免疫结合活性等性质,动物实验则验证抗体的生物学活性。主要研究结果如下:1.根据全人源噬菌体抗体库筛选获得的抗CPA的全人源单链抗体Sc Fv基础上,构建了ATG-Trx A-His Tag-Sumo-(+++++)-Tag表达载体,利用表达载体联合单链抗体轻链和重链恒定区基因组合成五个表达质粒分别为:PET-300-Trx A-Sumo-Sc Fv-CL-CH_2-CH_3、P ET-300-Trx A-Sumo-Sc Fv-CH_2-CH_3、PET-300-Trx A-Sumo-Sc Fv-CL-CH_2、PET-300-Trx A-Su mo-Sc Fv-CH_2、PET-300-Trx A-Sumo-Sc Fv-CL分别转入BL21(DE3)表达菌中,获得五个单分子抗体的表达菌,经IPTG诱导表达后,利用EILSA检测五种单分子抗体蛋白的抗原免疫结合活性,结果显示,Sc Fv-CH_2-CH_3(Sc Fv-Fc)的结合活性最高,因此后续实验均采用该重组抗体蛋白来完成。2.对重组表达菌E.coli BL21(DE3)/PAdezmapimod分子式ET-300-Trx A-Sumo-Sc Fv-Fc进行发酵培养并对发酵产物进行纯化,最终获得Sc Fv-Fc纯品(0.15mg/m L),用LSPR动力学分析显示,制备的Sc Fv-Fc与CPA的亲和常数(KD)为4.89×10~(-9)(M),说明该抗体对CPA具有较强的亲和力。3.动物实验验证单分子抗体的生物活性。在体内中和试验中,将2×LD_(50)CPA与Sc Fv-Fc按照不同比例混合孵育,当CPA与Sc Fv-Fc按Smoothened Agonist纯度1:7、1:8混合时小鼠几乎全部达到保护,当低于1:6时,则开始出现小鼠死亡,得出中和2×LD_(50)CPA所需最小Sc Fv-Fc的剂量为14.21mg/kg;在攻毒保护试验中2×Sc Fv-Fc(28.42 mg/kg)的抗体尾静脉注射小鼠,不同时间段以2×LD_(50)CPA攻毒,结果显示注射抗体1h内攻毒保护率可达到100%;在攻毒救治试验中,以2×LD_(50)CPA进行攻毒,在不同时间以单分子抗体进行救治,结果发现在30min内,救治率达90%,一小时内也高达60%,说明利用Sc Fv-Fc对CPA快速治疗具有很好的效果;小鼠体内半衰期的测定结果显示,Sc Fv-Fc的半衰期为198min±34min,相比较未改进前的Sc Fv体内存留时间(65min±30min)明显更长。本研究成功构建了抗A型产气荚膜梭菌α毒素的重组单分子抗体Sc Fv-Fc,并在体内外对其性质进行了研究,结果显示,构建的单分子抗体具有稳定性高、亲和力高、半衰期长的特点,本研究对蛋白的人源改造及安全性评价提供实验依据。