目的:研究显示,血清ALT正常的部分慢性HBV携带患者的肝组织已呈现较显著的炎症或纤维化,应及时启动抗病毒治疗。探讨慢性HBV携带者肝内免疫活化机制及早期的免疫学特征,将为探寻可靠血液指标来监测肝组织炎症变化,为尽早实施抗病毒治疗提供新思路。而目前还缺乏相关的研究报道。方法:1.本研究应用了一种HBV转基因小鼠(HBV-Tg)模型,该小鼠为HBV高水平复制,随月龄增加出现显著的肝组织免疫炎症。选择该小鼠1、3、6月时间点,动态观察在慢性HBV携带状态下肝组织炎症活化的过程。2.观察1、3、6月龄HBV-Tg小鼠外周血HBV DNA、HBe Ag及肝功水平,以及肝组织炎症程度。通过转录组测序(RNA-Seq)获得1、3、6确认细节月龄的HBV-NSC125066供应商Tg及野生型C57BL/6N(WT)小鼠肝组织转录表达谱数据,做基因表达差异分析。3.通过整合生物信息学工具,分析各时间点下HBV-Tg肝组织基因表达谱的动态变化,发现肝组织免疫炎症活化早期的基因表达特征。这些分析主要包括:基因表达变化的通路富集分析(GSEA及Metascape),免疫相关基因表达特征模块分析(WGCNA),免疫细胞浸润分析(CIBERSORT)。4.从GEO公共数据库中获取慢性HBV感染者及健康对照者肝组织表达芯片数据集(GSE83148),通过IRGs的一致性聚类识别“免疫耐受期”(“IT”)、“免疫活化早期”(“early-IA”),及“免疫活化期”(“IA”)样本,依照3的方法分析各期样本的基因表达特征,并与HBV-Tg小鼠各时间点的基因表达特征作比较。5.用转录因子富集分析(ENCODE、TRRUST)筛选介导HBV-Tg小鼠肝组织免疫炎症活化的转录因子。用免疫组化(IHC),免疫印迹(WB),实时荧光定量PCR(q-PCR)方法验证候选转录因子的活化及靶基因的表达。6.用候选转录因子特异性抑制剂进行干预,比较干预与未干预HBV-Tg小鼠的肝功能水平及肝组织炎症程度,并比较转录因子活化(WB、IHC)、靶基因表达(q-PCR),及肝内免疫细胞浸润(FACS),进一步验证候选转录因子在启动肝组织免疫炎症中的作用。结果:1.与同月龄的WT比较,仅6月龄HBV-Tg小鼠外周血ALT或AST水平显著升高(p<0.001和p<0.05)。HBV-Tg小鼠肝组织炎症程度随月龄逐渐增加,显示从1月龄无显著炎症(Scheuer评分1-2),3月龄轻度炎症(Scheuer评分1-3),到6月龄较强炎症(Scheuer评分3-4)的过程。2.与同月龄WT的肝组织转录组相比,HBV-Tg小鼠在1月的代谢相关通路显著增强而后逐渐回落;非特异免疫反应及炎症相关通路在1月无显著变化,在3月急剧升高,6月逐渐回落;而特异性免疫反应及白细胞活化相关通路主要在6月显著升高。3.免疫相关基因表达特征分析结果显示(与同月龄WT相比),HBV-Tg小鼠在1月龄时负调节免疫及炎症相关基因上调;3月龄时急性时相反应、炎症及趋化相关基因显著上调;6月龄时主要为适应性免疫相关基因显著上调。免疫细胞浸润分析发现,3月龄时单核细胞及M1型巨噬细胞的浸润分数显著升高(p<0.032和p<0.0079),6月龄时活化型CD8~+T细胞显著升高(p<0.0075)。4.GSE83148分析结果显示,与健康对照组相比,“IT”患者的负调节免疫及炎症相关基因上调;“early-IA”患者上调的基因主要为炎症相关基因,且单核细胞及M1型巨噬细胞的浸润分数显著升高(p<0.034和p<0.0033);“IA”患者上调的基因涉及炎症、趋化、非特异及特异性免疫应答等多个过程。分析还显示,“IT”,“early-IA”和“IA”患者肝组织免疫相关通路的活化程度分别与1,3和6月龄的HBV-Tg小鼠存在相似性。5.转录因子分析显示,在炎症相关基因显著活化的3月龄HBV-Tg小鼠及“early-IA”患者中,Stat3转录因子均显著富集;3月龄HBV-Tg小鼠的上调基因与Stat3靶基因的功能重叠显著增多,且大多与免疫炎症过程相关。免疫印迹,免疫组化,实时荧光定量PCR结果显示,HBV-Tg 3月龄小鼠Stat3活化水平(p Y705-Stat3)显著升高(p<0.01),且主要表达于肝细胞核中;Stat3活化相关靶基因A2m(p<0.01)、Saa1(p<0.01)、S100a8(p<0.01)、S100a9(p<0.01)和Icam1(p<0.05)等表达显著增强。6.Stat3活化抑制实验显示,经特异性抑制剂stattic处理后,HBV-Tg 3月龄小鼠肝组织p Y705-Stat3水平显著降低(p<0.001),炎症评分显著下降(p<0.01),炎症及趋化相关基因的表达显著减弱,外周炎性单核细胞(CD11b~+Ly6c~(high))(p<0.05)及肝内炎性单核来源巨噬细胞(F4/80~+CD11b~+Oral relative bioavailabilityLy6c~(high))(p<0.0001)浸润显著减少。结论:1.本研究采用HBV-Tg小鼠动态观察了慢性HBV携带状态下肝组织炎症活化的变化过程。2.本研究发现3月龄HBV-Tg小鼠为肝组织免疫炎症活化的较早阶段,与慢性HBV感染者免疫活化早期的免疫相关通路活化程度类似。3.本研究解析了在慢性HBV携带状态下肝内炎症活化早期的基因表达特征,并发现转录因子Stat3活化是介导这一过程的重要因素。