阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)又称老年痴呆症,是一种流行性中枢神经系统退行性疾病。截至目前为止,淀粉样蛋白级联假说仍是有关AD发病机制的主流学说,即认为脑内Aβ异常增多是AD发生的主要病因。研究表明,异常水解的Aβ在脑内聚集沉积形成的淀粉样斑块具有很强的神经毒性,可诱发神经炎症和突触丢失。小胶质细胞(Microglia,MG)是中枢神经系统(Central nervous system,CNS)中主要的免疫巨噬细胞。在正常生理状态下,MG以三种不同表型参与疾病的发生发展过程。在AD病理状态下,过度激活的小胶质细胞主要为M1型,释放炎性因子,加速神经元损伤。益智仁来源于姜科山姜属植物益智Alpinia oxyphylla Miq.的干燥成熟果实,具有神经保护、抗衰老、抗氧化的作用,具有较好的改善认知效果。诺卡酮(NOOTKATONE,NKT)又名圆柚酮,是益智仁中含量较高的萜类成分,研究表明,NKT可改善脂多糖诱导的AD小鼠学习记忆能力,减轻神经炎症反应和神经元损伤。然而NKT是否可以通过调节MG改善AD尚无报道。本研究以东莨菪碱、亚硝酸钠、乙醇诱导的记忆障碍小鼠以及Aβ1-42诱导的拟AD模型大鼠、Aβ1-42诱导的HMC3小胶质细胞,在体和离体探讨NKT对小鼠获得性、巩固性和再现性记忆、空间学习记忆能力的影响以及小胶质细胞相关机制,以期为AD治疗提供参考。研究目的:1、以东莨菪碱、亚硝酸钠、乙醇诱导的记忆障碍小鼠以及Aβ1-42诱导的拟AD模型大鼠为研究对象,观察获得性、巩固性和再现性记忆以及空间学习记忆能力的影响。2、以mitochondria biogenesisELISA法、q PCR法、免疫组化法、尼氏染色法、蛋白免疫印迹法等探讨诺卡酮改善Aβ1-42诱导的拟AD模型大鼠神经炎症和氧化应激的作用机制。3、通过靶向SIRT1调控HMC3小胶质细胞,进一步探讨诺卡酮干预小胶质细胞改善神经炎症和氧化应激的可能作用机制。研究方法:1、NKT对不同阶段记忆障碍小鼠学习记忆的影响ICR小鼠252只,SPF级,6周龄,体重约20g,雌雄各半。随机分成7组,每组36只。即正常对照组(Control)、模型组(Model)、诺卡酮低剂量组(7 mg/kg,NL)、诺卡酮中剂量组(15 mg/kg,NM)、诺卡酮高剂量组(30 mg/kg,NH)、银杏叶提取物组(36 mg/kg,EGb-671)、盐酸多奈哌齐组(1.5mg/kg,Donepezil)。灌胃给药14天后,分别采用腹腔注射3mg/kg东莨菪碱氢溴酸盐水溶液、背颈部皮下注射120 mg/kg亚硝酸钠、灌胃给予10 mg/kg 30%乙醇溶液建立小鼠获得性记忆障碍、巩固性记忆障碍、再现性记忆障碍模型,观察小鼠在跳台实验和避暗实验中的潜伏期及错误次数。2、NKT对Aβ1-42诱导的拟AD模型大鼠认知障碍及神经炎症、氧化应激的影响健康雄性SD大鼠共120只,SPF级,6周龄,体重约200 g。除假手术组(Sham),采用大鼠海马CA1区注射Aβ1-42方法建立大鼠认知障碍模型,造模后,大鼠被随机分成模型组(Model),NKT低剂量组(5 mg/kg,NL)、NKT中剂量组(10 mg/kg,NM)、NKT高剂量组(20 mg/kg,NH)、银杏叶提取物EGb-761中剂量组(25 mg/kg,EM),银杏叶提取物EGb-761高剂量组(50 mg/kg,EH),盐酸多奈哌齐组(1mg/kg,Donepezil),从术后第一天开始灌胃给药,共计40天。各组大鼠灌胃35天后进行Morris水迷宫试验,观察大鼠逃避潜伏期及穿越平台次数,行为学实验后过量麻醉处死,取大鼠右侧海马体于-80冰箱冻存,左侧脑组织固定于4%多聚甲醛。免疫组化法检测IBA1、CD206阳性细胞数和阳性面积,尼氏染色法观察大鼠海马CA1区神经细胞形态,ELISA检测大鼠海马组织i NOS、SOD、TNF-α、IL-6、IL-10的水平,q PCR法检测大鼠海马体SIRT1基因水平,蛋白免疫印迹法检测大鼠SIRT1、NF-κB、AMPK、P-AMPK蛋白表达。3、NKT对Aβ1-42诱导的HMC3小胶质细胞的影响使用Aβ1-42诱导HMC3小胶质细胞建立体外模型,并使用诺卡酮、SIRT1抑制剂(EX 527)、SIRT1激活剂(Resveratrol)进行干预,分为对照组(Control)、模型组(5μM;Model)、Aβ1-42+诺卡酮组(NKT:25、50、100Transmembrane Transporters抑制剂μM;NL、NM、NH)、Aβ1-42+EX-527组(5μM;EX-527)、Aβ1-42+Resveratrol组(5μM;Resveratrol),倒置显微镜观察HMC3小胶质细胞数量和形态变化,ELISA检测HMC3小胶质细胞和上清培养基中NOS、SOD、TNF-α、IL-6、IL-10的水平,q PCR法检测HMC3小胶质细胞SIRT1基因水平。研究结果:1、NKT能明显延长东莨菪碱所致获得性记忆障碍模型小鼠的潜伏期(P<0.05),降低跳台错误次数(P<0.05);减少亚硝酸钠所致巩固性记忆障碍模型小鼠错误次数(P<0.05);对乙醇诱导的再现性记忆障碍模型小鼠学习能力具有一定改善趋势,不具有显著性差异(P>0.05)。2、通过海马CA1区注射Aβ1-42建立拟AD模型大鼠,与假手术组相比,模型组大鼠出现空间学习记忆能力的下降和认知功能障碍,并伴随氧化应激损伤、炎症因子水平增加等现象(P<0.05)。NKT干预后,可显著提高模型大鼠Morris水迷宫行为学成绩,改善空间学习和记忆能力,上调SOD水平、下调i NOS水平(P<0.05),下调炎症因子IL-6、TNF-α水平(P<0.05),改善大鼠神经炎症反应。染色结果显示,模型组大鼠海马CA1区出现神经元变性、死亡、数量减少的现象,小胶质细胞数量增加(P<0.05)、M2型小胶质细胞标志物CD206表达量减少(P<0.05),海马组织中SIRT1表达减少,NF-κB表达量增加(P<0.05)。诺卡酮干预后海马CA1区细胞病理状态有所改善,小胶质细胞数量减少,M2型小胶质细胞标志物CD206表达增加,且SIRT1蛋白表达水平和基因水平上调(EPZ-6438采购P<0.05)。3、Aβ1-42诱导HMC3小胶质细胞后,细胞数量增加,胞体变大,突起减少,形态由“分枝状”变为“阿米巴状”。与对照组相比,Aβ1-42诱导的HMC3细胞中NOS水平显著增加(P<0.05),炎症因子IL-6、TNF-α水平显著增加(P<0.05),抗炎因子IL-10水平降低(P<0.05)。诺卡酮干预后,可改善细胞形态,下调NOS水平,降低炎症因子水平(P<0.05),改善氧化应激和炎症损伤;q PCR结果显示,诺卡酮可上调SIRT1基因表达水平(P<0.05)。结论:诺卡酮能提高记忆获得、巩固和再现三个不同阶段记忆障碍模型小鼠的学习记忆能力,能改善Aβ1-42所致拟AD模型大鼠空间学习记忆能力、缓解氧化应激及神经炎症损伤等,改善海马CA1区的细胞病理状态,其发挥作用的机制可能与升高SIRT1表达水平、从而对小胶质细胞M2型极化产生作用有关。