胞苷5′https://www.selleck.cn/products/Cisplatin.html-单磷酸(5′-CMP)是制备多种核苷酸衍生物的关键中间体,广泛应用于食品和制药行业。随着抗病毒、抗肿瘤等药物研发的深入以及嘧啶核苷功能性研究的不断拓展,嘧啶核苷的市场需求不断扩大,迫切需要开发廉价的可规模化应用的嘧啶核苷生产工艺。传统生产5′-CMP的方法主要包括核酸水解法和化学合成法。但是因核酸水解法和化学合成法存在反应时间长,分离工艺复杂等缺点。通过改造微生物,利用合成生物学等手段合成5′-CMP引起了广泛关注。本研究首次针对大肠杆菌(Escherichia coli),利用代谢工程手段开发一株生产5′-CMP的工程菌株,同时通过系统途径优化策略显著提高了其产量。具体主要内容包括:(1)以E.coli MG1655为出发菌株Medulla oblongata,通过代谢工程手段构建胞苷5′-单磷酸高效生产菌株。首先采用CRISPR Cas9基因编辑技术敲除5′-CMP降解途径,阻断5′-CMP的降解。通过敲除基因ppn N阻断5′-CMP至胞嘧啶的降解途径,敲除基因ush A、yrf G、yjj G、ump H、ump G,阻断5′-CMP至胞苷的降解途径,获得的菌株E.coli CM006可以积累5′-CMP,其产量可达133.4 mg·L~(-1),与野生菌株相比,实现了5′-CMP的积累。(2)通过提高5′-CMP合成途径中关键酶的表达量,提高5′-CMP的积累。通过过量表达CTP到5′-CMP的5′-CTP二磷酸水解酶基因nud G,进一步获得的重组菌株E.coli CM007,5′-CMP的产量积累到183.0 mg·L~(-1)。为减少中间代谢产物乳清酸的积累,表达乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyr E促进了5′-CMP的合成。通过整合表达尿苷酸激酶突变体基因Pyr H(D93A),弱化5′-CMP合成途径中的限速步骤,进一步构建获得重组菌株E.coli CM009的5′-CMP产量达到253.0 mg·L~(-1)。(3)通过减少胞苷积累,提高5′-CMP的积累。敲除胞苷脱氨酶基因cdd和过量表达尿苷-胞苷激酶基因udk,显著增加了5′-CMP的积累水平。整合表达PPP途径的关键酶基因prs、zwf、gnd,提高PPP途径的碳通量,增强前体物质PRPP的供应,构建获得重组菌株E.coli CM012的5′-CMP产量提高至417.9 mg·L~(-1)。(4)在菌株E.coli CM012基础上引入枯草芽孢杆菌的嘧啶操纵子基因簇,获得重组菌株E.colBemcentinib说明书i CM016,在E.coli中重构了UMP合成途径,提高合成5′-CMP的前体物质供应,5′-CMP的摇瓶发酵产量达468.0 mg·L~(-1),进一步提高了其积累量。