研究背景肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)是最常见的恶性肿瘤之一,也是迄今为止泌尿系肿瘤中最致命的。其发病原因包括肥胖、高血压、吸烟、遗传等。最常见的病理类型为肾透明细胞癌(clear cell Renal cell carcinoma,ccRCC)。由于影像学的进步,肿瘤的检测不断改善,越来越多的早期肾癌患者被发现并得到有效的治疗。但是,仍有20%-30%的患者在诊断时就发现了转移,即转移性肾细胞癌(metastatic renal cell carcinoma,mRCC)。此外,大约 20%-40%的患者在手术后出现复发及转移。由于RCC对放疗及化疗均不敏感,这无疑增加了治疗的难度,导致了晚期肾癌患者预后不佳。虽然目前已经开发了索拉非尼、舒尼替尼及抑制血管生成的酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitor,TKI)等靶向治疗药物,但是,它们对于患者生存期的改善仍十分有限。这需要我们不断探索、研究晚期肾癌临床治疗这一急需解决的重要难题。微量元素对人体健康至关重要,在机体构成、生理功能维持等方面起着重要的作用。正常情况下,人体的微量元素处于平衡状态。但是,当某种原因导致这种平衡被破坏时,此时多个器官未处在最佳状态,可导致多种疾病的发生。比如硒元素缺乏可导致克山病、甲状腺功能减退等疾病,锰元素含量过多可导致红细胞增多症、肝硬化等疾病。此外,流行病学显示微量元素紊乱与多种肿瘤相关,如乳腺癌、前列腺癌等。前期工作中我们课题组同学已对健康人及肾癌患者血清微量元素的含量进行了测试及分析,发现晚期肾癌患者血清硒的含量低于正常人及早期肾癌患者。因此,我们考虑硒元素可能影响肾细胞癌生物学行为,补充硒元素可能对晚期肾癌患者治疗具有一定帮助。本研究应用硒元素最常见形式亚硒酸盐GDC-0068生产商,验证亚硒酸钠对RCC细胞生物学行为的影响并初步研究了亚硒酸钠对RCC细胞的作用机制,最后验证了亚硒酸钠对裸鼠肾细胞癌移植瘤模型的生长是否具有抑制作用及对裸鼠有无明显毒副作用,希望对晚期肾癌患者的治疗提供一定的帮助。第一部分 亚硒酸钠对肾细胞癌细胞生物学行为的影响研究目的:通过体外实验验证亚硒酸钠对于RCC细胞增殖、凋亡、转移的影响,明确亚硒酸钠对于RCC细胞生物学行为的影响。研究方法:不同浓度的亚硒酸钠(0、2.5uM、5uM、10uM、20uM、40uM)处理RCC细胞系786-O细胞及ACHN细胞,通过光学显微镜观察作用不同时间后细胞形态及数量的变化。通过MTT实验、克隆形成实验验证亚硒酸钠对于RCC细胞增殖的影响。通过流Orthopedic biomaterials式细胞仪观察亚硒酸钠对RCC细胞凋亡的影响。通过细胞划痕实验、Transwell实验验证亚硒酸钠对于RCC细胞转移能力的影响。研究结果:通过光学显微镜观察,我们发现随着亚硒酸钠浓度的升高及作用时间的延长,细胞数量减少,细胞形态萎缩,细胞质颜色变深。通过MTT实验我们发现亚硒酸钠可有效抑制RCC细胞增殖活性,具有时间依赖性和浓度依赖性,克隆形成实验显示亚硒酸钠可抑制RCC细胞的克隆形成能力,流式细胞技术显示亚硒酸钠可引起RCC细胞凋亡,随着浓度的增高,其凋亡的比例增加。细胞划痕实验及Transwell实验显示亚硒酸钠抑制RCC细胞的迁移及侵袭。以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:亚硒酸钠对于RCC细胞的增殖具有抑制作用,并引起RCC细胞的凋亡。此外,亚硒酸钠对于RCC细胞的转移能力具有一定的抑制作用。第二部分 亚硒酸钠促进肾细胞癌细胞凋亡并抑制其转移分子机制研究研究目的:探讨亚硒酸钠促进RCC细胞凋亡并抑制其转移的分子机制。研究方法:为了检测亚硒酸钠是否通过内源性途径引起RCC细胞凋亡,我们应用荧光分光光度计检测了线粒体膜电位、活性氧含量的变化,进一步通过Real-time PCR检测凋亡相关mRNA表达水平的变化,Western Blot检测凋亡相关蛋白含量的变化。我们通过Real-time PCR及Western Blot检测肿瘤细胞转移相关MMP-9、E-cadherin、VEGF的mRNA表达水平及蛋白含量的变化。应用NAC调节ROS的含量验证亚硒酸钠是否通过ROS引起RCC细胞凋亡并抑制其转移。String数据库寻找ROS互作蛋白,并进一步通过Western Blot检测不同浓度亚硒酸钠作用于RCC细胞时NF-κB通路相关蛋白含量的变化。最后我们应用NAC调节ROS含量,通过Western Blot及细胞免疫荧光实验观察亚硒酸钠是否通过ROS影响RCC细胞NF-κB通路。研究结果:我们发现随着亚硒酸钠浓度的升高,线粒体膜电位(MMP)不断降低,细胞活性氧(ROS)水平不断升高。这提示亚硒酸钠通过内源性凋亡途径引起RCC细胞凋亡。内源性凋亡相关mRNA(Bcl-2、Bax、cIAP、xIAP)水平的变化及相关蛋白(Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase3)含量的变化更加充分说明亚硒酸钠通过内源性凋亡途径引起RCC细胞凋亡。我们发现随着亚硒酸钠浓度增加,E-Cadherin的mRNA表达水平及蛋白含量升高,而MMP-9的mRNA表达水平及蛋白含量降低。它们与上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)相关。此外,MMPs 与肿瘤微血管形成相关,微血管生成在肿瘤转移中起到重要作用,故同时检测了微血管形成相关VEGF的mRNA表达水平及蛋白含量变化,发现随着亚硒酸钠浓度的增加,VEGF的mRNA表达水平及蛋白含量下降。当我们向亚硒酸钠处理的RCC细胞加入活性氧清除剂NAC时,发现亚硒酸钠引起RCC细胞凋亡及对转移的抑制程度降低,说明亚硒酸钠通过ROS引起RCC细胞凋亡并抑制其转移。String数据库提示ROS与NF-κB通路相关蛋白可能存在相互作用。通过进一步实验,我们发现亚硒酸钠抑制NF-κB通路相关蛋白(P65及IκB-α)磷酸化,并抑制p-p65由细胞质进入细胞核,进而促进RCC细胞凋亡并抑制其转移,NAC的加入可以减轻亚硒酸钠对NF-κB通路的抑制。结论:亚硒酸钠通过内源性凋亡途径引起RCC细胞的凋亡,通过影响EMT及微血管形成相关蛋白、mRNA水平影响RCC细胞的转移能力。亚硒酸钠可通过ROS介导NF-κB通路的抑制进而促进RCC细胞的凋亡并抑制其转移。第三部分亚硒酸钠对肾癌移植瘤模型的影响研究目的:探讨亚硒酸钠对肾癌移植瘤模型的影响。研究方法:我们构建BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型,分为亚硒酸钠组及对照组。待肿瘤生长至一定体积后,亚硒酸钠组应用亚硒酸钠按2mg/kg每两天腹腔注射一次,对照组应用相同剂量的生理盐水。注射药物后每3天用游标卡尺测量移植瘤的长径和短径,并对小鼠进行称重。2周后处死小鼠,测量肿瘤的重量,TUNEL染色检测肿瘤凋亡,肺组织行病理切片检查,Western Blot实验检测凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-3、转移相关蛋白E-Cadherin、VEGF及NF-κB相关蛋白p-p65含量的变化。研究结果:亚硒酸钠组中肿瘤体积及重量低于对照组,两组小鼠体重无明显统计学差异。TUNEL实验发现亚硒酸钠可引起小鼠移植瘤凋亡。两组裸鼠肺组织病理切片无明显异常,未发现明显转移瘤,无明显间质性肺炎、肺纤维化等药物毒性改变。Western Blot实验检测显示亚硒酸钠可引起移植瘤细胞Cleaved-Caspase-3、E-Cadherin表达含量升高,VEGF表达含量降低,亚硒酸钠降低了移植瘤细胞NF-κB通路相关蛋白p-p6Belumosudil5的含量。结论:亚硒酸钠可抑制小鼠移植瘤的生长,并引起移植瘤的凋亡。亚硒酸钠可引起凋亡、转移、NF-κB通路相关蛋白含量的变化。两组裸鼠体重无明显统计学差异及肺组织切片无明显异常提示亚硒酸钠对小鼠无明显毒副作用。