研究背景及目的:人类乙型肝炎病毒(HBV)能够感染人类宿主并引发慢性持续感染,可能导致感染者出现肝炎、肝硬化、肝细胞癌,严重威胁人类生命健康。HBV基因组编码的乙肝病毒X蛋白(HBx),是一种具有多种调节功能的蛋白,参与宿主信号转导调节、基因转录、蛋白质降解等过程,在HBV高效复制、基因组整合、逃逸宿主免疫反应中发挥重要生物学功能,对HBV感染、疾病慢性化以及肿瘤的发生有重要意义。I型长弥散核元件(LINE-1)是人体细胞中唯一已知具有自主转座活性的非LTR逆转录元件,在基因组进化、基因组稳定性以及宿主天然免疫反应中均具有重要生物学意义。有关HBV与逆转录元件之间是否存在直接相互作用,目前仍缺乏广泛的证据。LINE-1在复制过程中可以破坏DNA的稳定性并激活干扰素信号系统,两者均可对HBV的感染复制及整合过程产生负面影响。作为应对措施,HBV可能会利用自身蛋白来抑制LINE-1的逆转座活性。HBx作为一种多功能调节因子,其C端功能区更是具有结合RNA、DNA能力,提示HBx蛋白作为HBV的重要组成成分,极有可能对LINE-1的活性存在调控作用,相关研究成果对深入考察HBV、LINE-1、天然免疫系统三者之间的关系将产生明确的指导作用。本研究拟聚焦HBx与LINE-1,围绕HBx是否影响LINE-1活性展开研究,逐步探讨HBx蛋白与LINE-1之间的相互作用、可能机制及其生物学意义。研究方法:1、考察HBx蛋白对LINE-1逆转座活性的影响:采用学术界广泛使用的、依赖报告基因表达的LINE-1逆转座活性实验,通过流式细胞学检测、Western blotting等实验方法,考察HBx是否影响LINE-1的活性。2、探索HBx蛋白调控LINE-1活性的分子机制:LINE-1的复制分为RNA转录、蛋白表达、RNP组装、TPRT及整合五大步骤。因此,通过Western blotting、Luciferase、co-IP、qRT-PCR等实验方法,分别考察HBx是否对LINE-1 5’-UTR启动子活性,LINE-1RNA稳定性、LINE-1蛋白ORF1p和ORF2p的表达及稳定性、LINE-1 RNP的组装及功能以及LINE-1的整合能力产生影响,探究HBx调控LINE-1活性的具体机制。3、鉴定HBx蛋白影响LINE-1活性的关键功能区:构建HBx的不同截短体或突变体,通过上述实验考察HBx影响LINE-1活性的关键功能区,并对HBx调控LINE-1活性的分子机制进行反向验证。4、解析HBx蛋白影响LINE-1活性的生物学意义:通过Luciferase、ELISA、qRT-PCR等实验方法考察HBx、LINE-1、干扰素三者之间作用关系;通过彗星实验方法考察HBx对LINE-1破坏基因组(或ds DNA)稳定性这一功能的影响。研究结果:1、HBx蛋白具有抑制LINE-1活性的功能通过LINE-1逆转录转座试验考察HBx对LINE-1逆转录转座活性的影响,结果发现:HBx蛋白可以有效抑制LINE-1的逆转座活性,且在一定程度内,这种抑制作用具有剂量依赖性。2、HBx结合并破坏LINE-1 RNA的稳定性对HBx蛋白抑制LINE-1活性的机制研究提示:HBx蛋白不影响LINE-1 5’-UTR的启动子活性;而是通过结合LINE-1 RNA,破坏LINE-1 RNA稳定性,从而下调LINE-1ORF1p和ORF2p蛋白的表达并发挥限制LINE-1活性的作用。3、HBx 120-141片段对HBx下调LINE-1逆转座活性十分重要实验结果表明,HBxΔ120-141不再能够有效结合并下调LINE-1 RNA,在对LINE-1活性抑制上也表现出功能性缺陷。4、HBx蛋白抑制LINE-1活性的现象具有潜在的生物学意义彗星实验结果表明,HBx在抑制LINE-1活性的同时,可以使基因组免于LINE-1复制过程中所产生的破坏;对细胞内干扰素表达水平的考察结果也证实,HBx可以下调LINE-1selleck产品对先天免疫系统的活化selleck合成能力。研究结论:本研究发现HBx蛋白可以识别LINE-1 RNA上的ORF1和ORF2区域,从而结合并破坏LINE-1 RNA的稳定性,进而下调LINE-1蛋白的表达,最后实现对LINE-1活性的抑制;HBx 120-141区域是HBx抑制LINE-1活性的关键功能区,缺失这一区域后,HBxΔ120-141不再能够实现对LINE-1 RNA的识别与结合;通过对LINE-1活性的抑制,HBx可以保护基因组(或其它双链DNA)的稳定性免受破坏,也可以在HBV复制期间降低细胞内的干扰素水平;本研究揭示了HBx具有调控LINE-1活性的全新功能与相关分子机制,解析了这一现象的潜在生物学意义,并讨论了其对HBV感染复制的可能影响,这是本研究的创新点。后续研究将进一步解析HBx在HBV感染复制过程中的作用与机制,从而为靶向HBx的药物设计,优化抗HBV治疗策略提供sexual transmitted infection更新的角度和更有效的参考。