目的:乙肝相关性肾炎(HBV-GN)是我国主要的继发性肾脏疾病之一,乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的表达可能在HBV-GN的发病机制中起到了至关重要的作用,然而具体机制尚不明确。足细胞焦亡是HBV-GN重要的病理变化之一,线粒体损伤与其密切相关;Micro RNA(mi RNA)被证明与机体多种生理病理过程有关,但其在HBV-GN足细胞焦亡中的作用尚不明确。因此,本研究的目的是探讨氧化应激及mi RNA在HBx蛋白诱导的HBV-GN足细胞焦亡中的潜在功能及相关机制。方法:分别采用小鼠肾足细胞和人肾足细胞中过表达HBx基因来模拟HBV-GN的发病机制。将小鼠肾足细胞分为以下5组:空白对照组(不予特殊处理)、阴性对照组(转染对照慢病毒)、HBx过表达组(转染HBx过表达慢病毒)、HBx过表达+NLRP3si RNA组(共转染HBx过表达慢病毒和NLRP3 si RNA)、HBx过表达+ROS抑制剂组(转染HBx过表达慢病毒和添加ROS抑制剂);人肾足细胞分为以下9组:对照组(不予特殊处理)、空质粒组(转染空质粒)、HBx过表达组(转染HBx过表达慢病毒)、HBx过表达+mi RNA-223 mimic组(共转染HBRoxadustat体外x过表达慢病毒和mi RNA-223模拟物)、HBx过表达+mi RNA-223 inhibitor组(共转染HBx过表达慢病毒和mi RNA-223抑制剂)、HBx过表达+mi RNA-223 mimic+NLRP3组(共转染HBx过表达慢病毒、mi RNA-223模拟物和NLRP3过表达质粒)、HBx过表达+mi RNA-223mimic+NLRP3 si RNA组(共转染HBx过表达慢病毒、mi RNA-223模拟物和NLRP3si RNA)、HBx过表达+mi RNA-223 inhibitor+NLRP3组(共转染HBx过表达慢病毒、mi RNA-223抑制剂和NLRP3过表达质粒)、HBx过表达+mi RNA-223inhibitor+NLRP3 si RNA组(共转染HBx过表达慢病毒、mi RNA-223抑制剂和NLRP3si RNA)。电镜下观察足细胞的形态学改变;二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法检测ROS的生成;Hoechst 33342染色观察足细胞细胞核的形态和数量变化;酶联免疫吸附测定试验分别检测胱天蛋白酶1(Caspase-1)酶活性、乳酸脱氢酶、白细胞介素(IL)-1β和IL-18水平;TUNEL染色和流式细胞术检测焦亡细胞数量;双荧光素酶报告基因实验验证mi RNA-223的下游靶标;免疫荧光染色检测Desmin和Nephrin的表达;实时荧光定量PCR和Western印迹法分别检测细胞焦亡相关蛋白如NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、Caspase-1、IL-1β和IL-18 m RNA和蛋白水平的表达。结果:(1)HBV-GN中ROS/NLRP3通路的作用:(1)HBx过表达慢病毒成功感Tezacaftor染足细胞后,电镜下观察到细胞发生焦亡相关形态学改变。(2)与阴性对照组相比,HBx过表达组ROS水平显著升高(P<0.05)。(3)Hoechst 33342染色发现HBx过表达后细胞核浓缩。(4)TUNEL染色和流式细胞术证明HBx过表达后足细胞发生了焦亡。(5)焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18 m RNA和蛋白表达显著上调(均P<0.05)。(6)Caspase-1酶活性、乳酸脱氢酶和Desmin表达水平升高(均P<0.05)。(7)NLRP3敲低或ROS抑制减弱了HBx过表达引起的足细胞焦亡以及相关蛋白表达增加(均P<0.05)。(2)HBV-GN中mi R-223对NLRP3的调控作用:(1)与对照组相比,HBx过表达组mi RNA-223表达较低(P<0.05)。(2)TUNEL染色和免疫荧光结果显示,敲低NLRP3减弱HBx过表达引起的足细胞损伤和焦亡(P<0.05)。(3)双荧光素酶报告基因实验证明NLRP3是mi RNA-223的下游靶点之一。(4)功能回复实验证明,NLRP3过表达削弱了mi RNA-223足细胞损伤的保护作用(P<0.05)。(5)mi RNA-223 mimic和NLRP3 si RNA的共同加入使HBx过表达诱导升高的NLRP3炎症小体及炎性因子表达下降,焦亡细胞数量减少(均P<0.05);而同时引入mi RNA-223 inhibitor和NLRP3过表达质粒则使足细胞中NLRP3炎症小体和炎性因子的表达、Caspase-1活性上调,焦亡细胞数量增加(均P<0.05)。结论:ROS/NLRP3通路在HBx过表达引起的足细胞焦亡中起着重要作用。此外,HBx可能通过下调mi RNA-223靶向NLRP3炎症小体促进HBV-GN足Reclaimed water细胞焦亡,mi RNA-223有望成为治疗HBV-GN的潜在靶点。