疫苗既是国家战略需求,也是生命和健康的重要保障。细胞基质决定着病毒类疫苗的安全性和有效性,因此是疫苗研发和生产的关键。人二倍体细胞是病毒类疫苗生产最理想的细胞基质。目前,国内批准使用的人二倍体细胞株资Fetal medicine源已逐渐减少、细胞代次相对较高且可用于疫苗生产的细胞代次受限,导致其难以满足大规模生产的实际需求。因此,建立符合生产要求的人二倍体细胞株,以及开展人胚肺细胞寿命延长等创新研究对病毒类疫苗行业高质量发展具有重要意义。本研究通过科研伦理审查后收集人工流产的健康人胚胎肺组织,分离培养了3株原代人胚肺成纤维细胞系,并建库保存。研究确定了人胚肺成纤维细胞的培养条件,并完成了细胞库的生长特性研究、遗传特性研究、内外源污染因子检查、成瘤性检查和支持病毒增殖研究等总体质量评价。同时利用慢病毒转染技术将SV40-LT基因导入人胚肺成纤维细胞,建立稳定过表达SV40-LT的人胚肺成纤维细胞系(MU-SVLs),以期延长人胚肺成纤维细胞的寿命建立永生化细胞系,并完成了MU-SVLs细胞系的SV40-LT基因表达稳定性、生长特性、遗传特性、成瘤性和支持病毒增殖等研究。1.用胰酶消化法从胎龄为15W、11W+5和11W+1的流产胚胎肺组织中分离并建立了3株人胚肺成纤维细胞系(MU-Ls),依次命名为MU-L1、MU-L2、MU-L3细胞。研究结果表明三株细胞为成纤维样表达,分别可传P67、P77和P75代,且冻存复苏后细胞活率较高,生长特性良好。研究确定的培养条件为:添加10%(v/v)新生牛血清的MEM培养基,1:4的分种率。2.研究三株人胚肺成纤维细胞不同生命代次的生长特性,发现随着细胞代次的增加,增殖能力减弱,β-半乳糖苷酶染色阳性率增强,均符合人二倍体细胞的生长特性。经检定,三株细胞具有人二倍体核型,无细菌、真菌、支原体和内外源病毒因子污染,无成瘤性,对EMCV具有敏感性,且病毒滴度均高于标准对照株MRC-5。3.利用慢病毒转染技术将SV40-LT基因分别导入人胚肺成纤维细胞MU-L1(P24)、MU-L2(P9)和MU-L3(P9)中,建立了3株过表达SV40-LT基因的人胚肺成纤维细胞系,依次命名为MU-SVL购买Cobimetinib1、MU-SVL2、MU-SVL3。在原有代次基础上,目前已分别传代培养至P90、P91、P89。MU-SVLs细胞染色体为二倍体核型INCB28060 MW(2n=46),且随细胞代次的增加,多倍体(2n>53)发生率增大。裸鼠荷瘤实验结果表明MU-SVLs细胞均无成瘤性。本研究成功分离培养了3株生物学特性良好、核型正常和无成瘤性的人胚肺成纤维细胞系,且对脑心肌炎病毒敏感,具有进一步研究和生产的价值。通过慢病毒感染技术构建了三株稳定过表达SV40-LT的人胚肺成纤维细胞系,其生命代次明显延长,永生化是有可能实现的。