目的:本研究旨在探究天然植物提取物丁香酚(EG)对临床分离的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)的抑菌效果,评价其对该菌生物膜的清除能力,观察EG作用后细胞膜及生物膜的形态学的变化,检测EG作用后细菌内物质泄露,探索EG对CRKP的作用机制,为清除CRKP及其相关感染提供新的替代治疗策略。方法:收集青岛大学附属医院检验科检出的CRKP;EG的抗菌活性检测采用琼脂板扩散法(CFU法)和细菌生长抑制曲线实验检测EG对CRKP的抑菌活性;利用激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)进一步研究了EG对CRKP生物膜的清除能力;使用扫描电镜(Scanning electron microscopy)和透射电镜(Transmission electron microscopy)点击此处观察EG对CRKP细菌细胞膜形态结构完整性的影响;利用β-半乳糖苷酶试验、蛋白泄露实验、DNA泄露实验测量细菌细胞膜结构损坏后细菌内物质的泄露水平;使用活性氧检测试剂盒测量处理后细菌内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成的水平;通过硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)测定和还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)测定实验来探究EG对CRKP的作用机制。所有数据均以(3±SD表示。统计分析使用Graph Pad PRISM 8.0进行,所有数据使用t检验来确定组间的差异,误差条表示每组3次实验的SD。星号代表在*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001时数据的显著差异。结果:EG的抗菌活性检测中琼脂板扩散实验和生长曲线实验结果表明,不同浓度的EG对CRKP均表现出较好地抑菌效果,0.5mg/m L EG杀死了超过85%的CRKP,当EG浓度为1.0mg/m L时,几乎100%的CRKP被根除,表明EG具有优异的抗菌活性(P<0.001),且EG对CRKP的抑菌活性具有浓度依赖性;在24 h内,不同浓度的EG表现出持续的抑菌效果,且随着EG浓度升高效果越明显,EG浓度为1.0mg/m获悉更多 L时,几乎无细菌存活(100%,P<0.001);生物膜实验的CLSM观察结果发现,EG使CRKP生物膜的平均厚度显著下降,且具有浓度依赖性(P<0.001);扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)结果发现,EG使CRKP的形态结构及完整性发生变化,包括细菌细胞膜的损坏及细菌内物质的泄露,并随EG浓度增加genetic loci细菌膜结构损伤及细菌内物质泄露越多;ROS检测试剂盒检测到,在EG处理24h后,CRKP胞内荧光强度与空白对照组相比均显著增加(P<0.001),且具有浓度依赖性;硫代巴比妥酸(TBA)测定和还原型谷胱甘肽(GSH)测定实验结果表明,EG可以通过诱导高ROS表达和GSH降低来执行对CRKP的抗菌活性,从而破坏细菌膜并导致细菌死亡(P<0.001)。结论:天然植物提取物EG对CRKP有明显抑菌效果,并对其生物膜有较好的清除能力,实验发现EG可以导致细菌膜结构完整性的损坏以及细菌内物质的泄露,通过介导高ROS表达和GSH降低导致膜脂质过氧化机制进而导致细菌死亡。因此,EG作为清除CRKP的替代治疗策略具有良好的应用前景。